猪FMDV受体β3亚基配体结合域的基因克隆及其多克隆抗体制备

1、猪FMDV受体3亚基配体结合域的基因克隆及其多克隆抗体制备         11-02-08 11:08:00     编辑：studa20             作者：独军政, 高闪电, 常惠芸, 丛国正, 林彤, 邵军军, 刘湘涛, 才学鹏【摘要】  目的: 克隆猪FMDV受体3亚基的配体结合域(LBD)基因, 利用原核细胞表达3亚基的LBD

2、片段, 纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法: 利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆3亚基的LBD基因, 将其与pGEM T-easy载体相连构建pGEM/3LBD, 经BamH /Xho 酶切后回收3LBD片段, 与同样酶切处理的原核表达载体pGEX 4T-1相连, 构建原核表达质粒pGEX/3LBD, 将其转化感受态细胞BL21(DE3), 以IPTG诱导表达3LBD蛋白。纯化目的蛋白后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果: 猪3亚基的LBD基因含有507个核苷酸, 编码169个氨基酸, 猪3 LBD基因与牛、

3、人、 黑猩猩、 猕猴、 马、 犬、 挪威大鼠、 家鼠、 和鸡的3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90.3%、 92.3%、 92.1%、 91.3%、 90.5%、 90.3%、 87.8%、 85.2%、 79.5%。哺乳动物的3亚基LBD基因同源性较高, 与鸡的同源性较低。实现了重组猪3 LBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达, SDS-PAGE显示其相对分子质量（Mr）约为44 000, 制备的兔多克隆抗体效价达112800以上。结论: 实现了猪FMDV受体3 LBD的基因克隆、 原核表达和多克隆抗体的制备, 为深入研究受体3亚基在FMDV感染过程中的作用机制奠定了基础。 【关键词】

4、0; FMDV病毒受体 猪3LBD基因 原核表达 多克隆抗体Abstract  AIM: To clone and express the ligand binding domain (LBD) cDNA of porcine integrin 3 as foot-and-mouth disease virus (FMDV) receptor and prepare its polyclonal antibody. METHODS: The LBD cDNA of porcine 3 was obtained from the lung tissue of pig infected

5、with FMDV by RT-PCR, and the recombinant plasmid pGEM/3LBD was constructed. After digested with BamH /Xho , the 3LBD fragment was subcloned into prokaryotic expression vector pGEX 4T-1. The recombinant expression plasmid pGEX/3LBD was constructed and transformed into E.coli BL21(DE3). The recombinan

6、t porcine 3LBD protein was expressed after IPTG induction and purified from total protein of BL21(DE3). The rabbits from New Zealand were immunized with the purified fusion protein to prepare polyclonal antibody, which was identified by Western blot and ELISA. RESULTS: The 507 bp cDNA of porcine 3LB

7、D encoded a polypeptide of 169 amino acids. The similarity of nucleotide sequence 3LBD between pigs and cattle, human being, chimpanzees, rhesus monkeys, horses, dogs, Norway rats, mice, chickens was 90.3%, 92.3%, 92.1%, 91.3%, 90.5%, 90.3%, 87.8%, 85.2%, 79.5%, respectively. The 3LBD gene of mammal

8、s exhibited high sequence homology. The recombinant 3LBD protein was expressed efficiently as inclusion body after IPTG induction and was approximately 44 000. The titer of the polyclonal antibody against the purified 3LBD protein was about 112800 by ELISA. CONCLUSION: The gene cloning and expressio

9、n of 3LBD and the preparation of its polyclonal antibody lay a foundation for further research into the interaction of FMDV with 3 subunit of porcine integrin.KeywordsFMDV receptor; ligand binding domain cDNA of porcine 3; prokaryotic expression; polyclonal antibody病毒感染宿主细胞的第一个步骤是病毒与受体结合, 在受体的介导下病毒粒

10、子才能进入细胞内。已经发现的口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease, FMDV）受体分为类: 整联蛋白（integrin）和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）1。口蹄疫田间分离毒株仅利用整联蛋白作为受体, 而口蹄疫细胞适应毒株则除了利用整联蛋白外, 还可利用HSPG作为受体。许多实验表明,   HSPG对FMDV来说可能是一种替换受体, 或是该病毒感染进入细胞的一种旁路途径2。整联蛋白可与含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Giy-Asp, RGD）基序的蛋白配体结合, 而RGD基序在FMDV VP1的

11、G-H环中高度保守, 这是整联蛋白成为FMDV受体的分子基础。1995年, Berinstein等3发现人源玻连蛋白（vitronectin）受体v3的抗血清和v3的单克隆抗体（mAb）均能阻断FMDV对易感细胞的感染, 由此认为v3是该病毒的细胞受体。这是第一个被发现的FMDV 受体。v和3亚基均有自己特异的配体结合域（ligand-binding domain, LBD）, 可与病毒配体相互作用。研究表明, 3亚基胞外域中的169个氨基酸参与构成了LBD4。虽然体外实验证明FMDV可以利用人整联蛋白作为受体进入细胞, 但在自然条件下这种病毒并不引起人类的疾病, 为了阐明FMDV与自然宿主猪

12、的相互作用关系, 继制备了牛vLBD多克隆抗体后5, 本试验首次从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆到了3亚基LBD基因并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析, 实现了重组猪3LBD的高效表达并制备了兔多克隆抗体, 这为深入揭示猪v3受体在FMDV感染过程中的作用机制奠定基础。1  材料和方法1.1  材料  FMDV实验感染猪肺组织、 大肠杆菌菌株DH5和BL21（DE3）、 原核表达载体pGEX 4T-1均由家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存; RNA提取试剂盒购自Qiagen公司; 限制性核酸内切酶、 IPTG、 X-gal、 DNA marker

13、、 DNA片段纯化试剂盒、 one step RT-PCR试剂盒均购自宝生物（大连）公司; T4连接酶为Promega公司产品; 低分子量蛋白标准购自中国科学院上海细胞生化所; 溶菌酶、 弗氏佐剂均为Sigma公司产品; 硝酸纤维素（NC）膜、 透析袋为Pharmacia公司产品; HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 其他试剂均为国产或进口分析纯。健康新西兰大白兔（3月龄, 雄性, 体质量约2 kg）由兰州兽医研究所实验动物场提供。1.2  方法1.2.1  引物  参考GenBank中不同动物来源的3基因序列设计2条引物: P1: 5-

14、GTGGGATCCCCCCAGCGGATCTTGCTCCG3; P2: 5-CGACTCGAGCTTGGCATCGGCGGTAAACA-3, 这对引物用于扩增猪3亚基的LBD基因, 预期大小约500 bp。P1和P2引物的5端分别引入了酶切位点BamH和Xho, 用于构建原核表达质粒。1.2.2  RNA提取与RT-PCR  将猪肺组织置于液氮预冷的研钵中, 研磨至无肉眼可见颗粒, 期间不断加入少量液氮, 参考RNA提取试剂盒操作说明提取细胞总RNA。按试剂盒说明进行RT-PCR反应, PCR产物经10 g/L琼脂糖电泳观察结果。1.2.3  基因克隆与序列分析&

15、#160; 将纯化的PCR产物和pGEM T-easy载体进行连接、 转化, 小剂量制备质粒, PCR、 酶切鉴定后将初步确定为阳性的重组质粒pGEM-3LBD送上海生工生物工程公司测序。重组质粒序列测定后, 借助DNAstar、 BioEdit、 Mega3.1等生物学软件对所测序列与参考序列比较分析。参考基因及GenBank登录号为: 牛3(AF239959)、 人3（J02703）、 猕猴3(XM001116013 )、 犬3(AF116270)、 家鼠3(BC125518)、 挪威大鼠3(NM153720)、 马3（NM001081802）、 黑猩猩（XM523684）、 鸡3（NM2

16、04315）。1.2.4  重组表达质粒的构建和表达  重组质粒pGEM-3LBD经BamH/Xho双酶切后, 回收3LBD片段, 与同样酶切处理的pGEX 4T-1载体连接, 转化大肠杆菌DH5, 随机挑取单个菌落小剂量制备质粒, PCR、 酶切、 测序鉴定, 将测序正确的重组质粒pGEX/3LBD转化大肠杆菌BL21(DE3), 挑取单菌落接入10 mL LB/Ampr 培养液中, 37振摇培养过夜, 次日按1100将菌液接入LB/Ampr培养液, 37振摇培养24 h至A600值达到0.30.5时, 加IPTG至终浓度1 mmol/L, 继续培养46 h后进行SDS-

17、PAGE分析目的蛋白的诱导表达情况。1.2.5  蛋白纯化及其多克隆抗体的制备  将诱导表达的菌体收集后, 离心收集沉淀, 加入超声缓冲液冰上间歇超声, 离心弃上清, 重复上述步骤34次。沉淀加适量上样缓冲液, 重悬后沸水煮5 min后上样, 电泳结束后用预冷的0.1 mol/L KCl 浸泡胶至显示出乳白色的蛋白条带, 切下目的条带放入透析袋内, 用水平电泳洗脱装置洗脱目的蛋白, 取样进行SDS-PAGE电泳。以纯化的3LBD蛋白免疫3月龄雄性新西兰大白兔。初次免疫用500 g重组蛋白, 与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀后于背部皮下多点注射。4周后第1次加强免疫用250 g重组蛋白, 与等体积的不完全弗氏佐剂混匀后于背部皮下多点注射。之后隔2周加强免疫1次, 并于2次加强免疫后第10天经心脏大量采血, 按常规方法分离制备血清。以ELISA方法和Western blot分析确定抗体的效价和特异性。2