由一株放线菌产生的抑制VCAM-1表达的活性物质研究

1、由一株放线菌产生的抑制VCAM-1表达的活性物质研究         【摘要】  以VCAM-1为靶位点，使用含有荧光素酶报告基因的转染细胞株筛选模型从微生物的代谢产物中高通量筛选能够抑制VCAM-1表达的生物活性物质，以期找到能够治疗诸如类风湿性关节炎等免疫性疾病的新型药物。在筛选过程中使用有机溶媒萃取、ODS反相柱层析、HPLC制备等方法，从一株放线菌来源的发酵液中分离到了一个对测活用细胞株的荧光素酶报告基因的表达有较强抑制作用的化合物，其IC50为10.8mol/L，经理化性质及NMR分析确定该化合

2、物与文献报道的glucopiericidin A同质。 【关键词】  VCAM-1； Glucopiericidin A； 抗炎症剂； 荧光素酶   ABSTRACT  Focused on the VCAM-1 as the research target, we used a stable transfected cell line carrying the luciferase report gene in high throughput system to screen bioactive compound that prevent the ex

3、pression of VCAM-1 for  searching new drugs of treating immunological diseases such as rheumatoid arthritisr from the metabolites of microorganisms. In the course of screening, one active compound was isolated from the mycelium of actinomycetes by solvent extraction, ODS column chromatography a

4、nd HPLC purification etc. This compound showed moderate strength inhibitory activity against the luciferase report gene expression of the assay cell line and the IC50 is 10.8 mol/L. The structure of this compound was elucidated to be identical with glucopiericidin A by means of physico-chemical prop

5、erties and NMR analysis.   KEY WORDS  VCAM-1;  Glucopiericidin A;  Antiphlogisties;  Luciferase   黏附分子(adhesion molecules)是涉及细胞-细胞、细胞-细胞外基质间相互识别、相互作用的一类表面大分子受体蛋白，它广泛分布于多种细胞表面，通过与相应配体的特异性结合影响多种病理、生理过程如炎症反应、创伤愈合、肿瘤发生与转移及细胞分化等。目前已经发现的黏附分子主要分为三大类即整合素(integrins)、选择

6、素(selectins)及免疫球蛋白超家族分子(member of the immunoglobulin)。其中白细胞表面的整合素和选择素主要调节循环细胞与内皮的黏附，而内皮细胞上的整合素和免疫球蛋白超家族成员则主要调节内皮对白细胞的黏附1。与黏附有关的免疫球蛋白超家族分子最重要的有两种， 它们是ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)和VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)2，其中ICAM-1的表达是组成性的，即在通常状态下细胞表面就有一定程度的表达；VCAM-1的表达是非组成性的，即在通常状态下细胞表面表

7、达很少或不表达3。VCAM-1在细胞因子(如TNF-、IL-1等)或内毒素的刺激下表达于内皮细胞、上皮细胞及树突状细胞的表面，可介导与白细胞与内皮细胞的黏附，引导炎症反应由急性期转向慢性期的过度阶段单核细胞和嗜酸性细胞的集聚4，5。   类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)为对人类健康影响较大的一种常见病，目前尚无理想的特效治疗药物。该病最重要的病理特征是持续存在的滑膜炎，其表现为滑膜组织中炎性细胞的大量浸润和微血管数量的明显增多，这些炎性细胞在类风湿性关节炎的发病过程中起着重要的作用，而包括ICAM-1和VCAM-1在内的细胞黏附分子对炎性细胞

8、对滑膜组织浸润的发生具有很重要的作用。实验表明，在类风湿性关节炎的滑膜组织中ICAM-1和VCAM-1的表达明显增多，而骨关节炎(osteoarthritis，OA)和正常滑膜则无此现象。包括VCAM-1在内的细胞黏附分子在类风湿性关节炎滑膜症的形成过程中的作用主要有：(1)介导白细胞和内皮细胞的黏附；(2)协助各种细胞间接触，传递抗原递呈和细胞激活时的共刺激信号；(3)促使白细胞与基质分子的黏附，使白细胞滞留在炎症部位1，6。   通过抑制VCAM-1的表达阻止由其介导的白细胞和内皮细胞的黏附等病理过程的进行是寻找治疗类风湿性关节炎药物的一条新途径。炎症性细胞因子TNF-

9、、IL-1等引起VCAM-1的表达是通过TNF-与其细胞膜上相应的受体结合引起转录因子NF-B的活化这一细胞信号转导过程进行的7。我们将含有VCAM-1启动子和荧光素酶报告基因的重组DNA转染来源于人脐带内皮细胞的细胞系ECV304，构建细胞筛选模型，利用该筛选模型高通量筛选微生物来源的能够特异性抑制VCAM-1表达的生物活性物质，以期找到能够治疗类风湿性关节炎等免疫性疾病的新型药物。   利用该模型对微生物来源的发酵液样品进行筛选的过程中，对一株放线菌670所产生的具有抑制VCAM-1表达的活性物质进行了分离纯化、结构解析及活性评价。   1 

10、; 材料与方法   1.1  细胞培养   活性测定所用细胞来源于人脐带内皮细胞系ECV304，为贴壁型细胞。在含10% FBS的DMEM/F-12(GIBCO BRL公司生产)的培养基中于37、5% CO2的条件下每天分裂一次。   1.2  样品对VCAM-1表达的抑制活性的测定810   取培养好的细胞用上述培养基配制成1.5×105个/ml的细胞悬液，用八联移液器按每孔200l将细胞悬液注入到96孔板上，使每孔中有3×104个细胞。37、5% CO2条件下培养5h，按

11、每孔5l加入待测样品，对照孔不加样品。于37、5% CO2培养箱中培养1h，各孔中分别加入浓度为440ng/ml的人TNF-，使每孔中TNF-的浓度为20ng/ml，于37、5%  CO2培养箱中培养19h。   弃去上层培养液，每孔中加入荧光素酶测活缓冲液(30mmol/L Tricine，pH7.8，含8mmol/L乙酸镁；0.2mmol/L EDTA 1.5mmol/L ATP；0.5mmol/L CoA；0.5mmol/L luciferin；0.1% Trition X-100；100mmol/L巯基乙醇)50l，振摇10min，使用Top count(

12、Packard)测各孔每分钟的发光数(cpm)。   由荧光素酶催化的以荧光素(luciferin)为底物的发光反应的反应式为   样品对测活系统的抑制活性的计算公式为   抑制率=对照孔发光数-样品孔发光数÷对照孔发光数×100%   选取对VCAM-1表达抑制剂筛选系统的抑制率大于50%的样品为阳性样品；使用同样原理构建的另一细胞模型作为对照来评价样品活性的特异性。   1.3  菌株670的形态学研究   菌株670菌体中二氨基庚二酸(DP

13、A)异构体的测定使用Takahashi等11报道的方法，主要的甲基萘醌类物质的提取和分离使用Collins等12的方法，其中HPLC的分离方法为：层析柱:Capcell Pak C18 SG 4.6mm×150mm，流速1ml/min，流动相甲醇丙醇(73)，检测波长220nm。   菌株培养特征和生理学的研究使用Shirling等13提出的ISP培养基(The International Streptomyces Project media)以及Waksman14提出的培养基。培养物在27培养两周后进行观察，颜色的描述参考Color Harmony Manual

14、第四版15(1958年)，使用含有1%碳源的培养基16进行碳源的利用试验。            1.4  菌株670的发酵   于500ml的三角瓶中装入100ml种子培养基(含2.4%淀粉，0.1%葡萄糖，0.3%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%酵母粉，0.4% CaCO3，pH7.0)，接种后28培养3d，按10%的接种量将一级种子接种于装有的100ml发酵培养基(含4.0%可溶性淀粉，2.0%脱脂大豆粉，0.05% FeSO4·7H2O，0.05%

15、 K2HPO4，0.03% KCl；pH6.5)的三角瓶中，28振摇培养6d。   2  结果与讨论   2.1  菌株670的形态学特征与菌株的分类   菌株670的营养菌丝在合成和复合培养基上均生长丰富，菌丝体不易断裂。气生菌丝在燕麦牛肉膏琼脂和无机盐-淀粉琼脂培养基上均生长旺盛。孢子链为直链可弯曲型(rectiflexibile type)，每条孢子链含有20个以上的孢子。孢子为圆柱状，体积为1.1m×0.7m，表面光滑。没有发现孢子囊和带鞭毛的孢子。   全菌株细胞的DAP异构

16、体为LL-型，主要的甲基萘醌类物质为MK-9(H6)。   营养菌丝在各种培养基上呈灰棕色到褐色，气生菌丝颜色为白色到灰色。在酪蛋白胨-酵母膏培养基中可产生可溶性色素。菌株对碳源的利用情况和生理学特征和分别见Tab.1和Tab.2。综合上述分类学特征，将菌株670归属至链霉菌属。   2.2  菌株670产生的活性化合物的分离纯化   菌株670的发酵液3000ml于3000r/min离心15min，得上清液2300ml，菌体410g。上清液用2300mlEtOAc抽提二次，EtOAc层经无水Na2SO4脱水后减压浓缩抽干得

17、茶色油状物318mg。菌体用500ml丙酮抽提一次，3000r/min离心15min，取上清减压抽去丙酮得水溶液350ml，水溶液用500ml EtOAc抽提两次，EtOAc层用无水Na2SO4脱水，减压浓缩抽干得茶色油状物173mg。菌体和上清EtOAc抽提物共490mg上ODS柱(ODS干重250g，用30% CH3CN平衡)，分别用30%、45%、60%、80%和100% CH3CN各50ml洗脱，5ml/管收集洗脱液。测各管活性(Fig.1)，收集合并活性峰A和B。减压抽干分别得浅黄色物质62.7和10.6mg。   混合物A经HPLC分离(Fig.2，层析柱：YM

18、C-Pak ODS AM 20mm×300mm，流速6ml/min，流动相25% CH3CN，检测波长220nm)得活性化合物b(10.7mg)。   2.3  化合物b的抗菌活性   取1mg/ml的活性化合物b的溶液(用50%甲醇配制)10l滴于直径6mm的纸片上，用琼脂糖平板扩散法测得的抗菌谱见Tab.3，该化合物仅对Pyricularia oryzae显示出一定的抗菌活性(Tab.3)。   2.4  活性化合物b对荧光素酶报告基因表达的抑制作用   不同浓度的化合物b对荧光素

19、酶报告基因表达的抑制作用活性测定结果见Fig.3，其IC50值为10.8g/ml。由Fig.3得知，化合物b对荧光素酶的表达有较强的抑制作用并具有剂量依赖性。   2.5  化合物b的理化性质和化学结构   利用HPLC制备得到的化合物b为白色无定形粉末，呈现弱酸性，可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮和氯仿，几乎不溶于水。从质谱分析得知该化合物的分子量为577，分子式为C31H47O9N。用5mol/L HCl在60水解20min并用气相色谱分析得知有D-葡萄糖产生。该化合物的理化性质见Tab.4。   综合化合物b的理化性质、通过

20、检索相关的化合物数据库，发现该化合物与1987年Mastumoto等17报道的化合物的理化性质非常相似，在此基础上，通过对比化合物b与文献报道的化合物glucopiericidin A的1H-NMR、13C-NMR的测定结果，最终决定化合物b的化学结构与glucopiericidin A同质，其化学结构见Fig.4。   Glucopiericidin A最早被发现和报道具有抑制抗体产生的作用。小鼠急性毒性实验显示，静脉注射glucopiericidin A 10mg/kg的剂量，实验动物均保持存活。Glucopiericidin A所具有的较强的抑制荧光素酶的报告基因表达

21、的生物活性，以前尚未发现有关的报道。   细胞因子与人体内疾病有双重的关系，一方面细胞因子可以抗御和治疗某些疾病，另一方面细胞因子可以导致和促进某些疾病(如移植排斥、自身免疫疾病、感染性休克等)的发生18，例如作为人体内重要细胞因子的TNF-和IL-1通过参与激活血管内皮细胞，增加内皮细胞黏附分子的表达，使中性粒细胞滑膜腔内聚集，并进一步刺激滑膜细胞和中性粒细胞产生前列腺等炎性介质，产生胶原酶及其它中性蛋白酸类，释放骨钙等，导致滑膜、软骨和软骨下骨的破坏，在类风湿性关节炎的发病机理中起着非常重要的作用19。临床上为了抑制细胞因子引起的某些病理反应，可利用细胞因子抑制剂治疗多

22、种与之相关的疾病。我们选择与炎症性细胞因子有关的、在类风湿性关节炎等疾病的发生过程中起重要作用的荧光素酶为靶位点，筛选到了具有抑制VCAM-1表达的活性化合物b(glucopiericidin)并首次报道了该化合物对VCAM-1表达的抑制活性。今后通过对glucopiericidin及其它微生物来源的具有抑制VCAM-1表达的生物活性物质的研究有可能找到治疗诸如风湿性关节炎等疾病的新型药物。【参考文献】  1 翟中和主编. 细胞生物学动态M. 北京：北京师范大学出版社，1997：170.2 Osborn L, Hession C, Tizard R, et al. Direct expression cloning of vasular cell adhesion molecule 1, a cytokine induced endothelial protein that binds to lymphocytes J. Cell,1989,59(6):12031211.3 金伯泉主编. 细胞和分子免役学M. 西安：世界图书出版公司，1995：34.4 Cronsfein B N, Weissmann G. The adhesion molecules of inflammation J. Arthritis Rheum,1993,36:147157.5 Cybuls