大肠杆菌表达重组蛋白的细胞冻融与超声破碎

1、大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一 可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1. 仪器与材料：-80C冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或 50mM Tris-HCI pH 7.5 ; 50ml离心管；冷冻高速离心机2. 方法2.1 反复冻融2.1.1收集菌液 500ml，等分10份，4000 r/min4C离心15min，弃上清。2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS或50mM Tris-HCl （选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和口 EDTA带His标签不加）,PMSF终浓度为

2、100 g g/ml,EDTA的终浓度为。取20 g l重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。2.1.4 将菌液（经检测有表达）在 -80 度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高 引起溶胀，使细胞结构破碎。2.2 超声波处理 （ 对超声波及热敏感的蛋白慎用 ）2.2.1将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml溶菌酶，缓冲液 pH> 8.0，加入后需静置 20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作 5 秒，间隔 5 秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变

3、清澈为止，大约花费时间。2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液， 10000rpm 离心 10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。（ 2） 功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4 度左右，超声时保持冰浴。（ 3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。（4）可通过SDS-PAGE电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。二 包涵体蛋白的纯化1 菌体的破碎 (加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，

4、包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了)1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或 20mM Tris-HCI pH 7.5 ;裂解液bufferA ;溶菌酶10mg/ml; 50ml , 15ml离心管；冷冻离心机1.2 方法 收集菌液 500ml，等分10份，4000 r/min 4C离心15min，弃上清。(2) 菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mM PBS或20mM Tris-HCl (选择使蛋白稳定的缓冲液和pH, 般为7.5-8.0 )，重悬洗涤 2-3次，弃掉上清。(3) 然后沉淀按原菌液体积每 500ml以15ml预冷的裂解液buffe

5、rA 重悬。(有的文献为每克湿菌加 4ml -10ml裂解液)(4) 每毫升悬液中加入 100ul 10mg/ml 溶菌酶(即溶菌酶终浓度 1mg/ml) 。在冰上孵育 15min(5) 对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。(6) 4C，4000 rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.2 包涵体的洗涤(1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲(1-4M)的Buffer A 中，每克湿重加4

6、-6ml洗涤液。(2) 超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4C涡旋悬液30min。或者高速搅拌悬液 10min。 4 "C， 4000 rpm/min 离心 15 分钟。(4) 重复上述操作 2 次至上清液透明无色。(5) 将包涵体沉淀重悬于 Buffer A ， 4C， 4000 rpm/min 离心 15 分钟，弃掉上清。BufferA 50mM Tris-HCl pH 8,0.2mM EDTA,100mM NaCl,1% Triton x-100（或 2% 脱氧胆酸钠）1mM DTT1mM PMSF溶菌酶 10mg/ml注意事项：包涵体洗涤时增加 N

7、aCI浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。 经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。(3) 包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。(4) 用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下： 菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的Buffer A 中，4C涡旋悬液 30min , 4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。 取一小部分上清用 Buffer A 稀释到盐酸胍浓度为 4 M,然后4C涡旋悬液15min，静置30min，400

8、0r/min离心20min，上清继续稀 释到3M,重复上面操作一直到 2M把每次沉淀和上清跑 SDS-PAGE!泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。(3)摸索好条件后，直接将剩余上清直接用Buffer A稀释到所需的盐酸胍浓度，然后4C涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定方法很多，每种方法都有其自身的优点和缺点以及适用范围，不同的实验条件下得到的蛋白测定浓度需要根据纯化蛋白 缓冲体系选择合适的测定方法。一、考马斯亮蓝法( bradford 法)在本实验室中主要用来检测经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后蛋

9、白浓度测定(一)实验原理 考马斯亮蓝法(bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值 A595，与蛋白质浓度成正比。/&B le'bradford 法的突出优点是： G_Z |( 1 )灵敏度高 %w(2) 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。（3）干扰物质少。如干扰 lowry法的K+、Na+、M

10、g2离子、tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。za1 z:+t此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用G球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。#（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂triton x-100、十二烷基硫酸钠（SDS和0.1M的NaOH k%n­*（3） 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。+（二）试剂与器材 61. 试剂： &

11、shy;Q*H:（1） 标准蛋白质溶液，用G 球蛋白或牛血清清蛋白（BSA），配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2） 考马斯亮蓝 G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝 G-250，溶于50ml 95%勺乙醇后，再加入 120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升SY0;.Rg2. 器材： =A7z­Uj g（ 1 ）可见光分光光度计 b Z! ?4（ 2）旋涡混合器CV­|h6-#（ 3）试管 16 支 = HB!9（三）操作方法 |O!=r1. 标准方法（要用 96孔板进行实验，方法参照 pierce 公司试剂盒，此方法可以保留，但

12、是要加 96 孔板实验方法） $t（1）取 13支试管， 1 支作空白，其余试管分为两组，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml 的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0（空白）、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入 5.0ml考马斯亮蓝 G 250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。2 U:X（2） 加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值 A595,空白对照为第1号试管，即0.1ml H2O力卩5.0ml考马斯亮

13、蓝 G-250试剂。NI S3 *注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 H（3） 另取O.1mL未知浓度的蛋白溶液同上测定cL!3（ln?（4） 用标准蛋白质量（mg为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。N L9 V0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。?8Z k72. 微量法 xtiRuXj6R当样品中蛋白质浓度较稀时（10 100 ug/ml ）,可将取样量（

14、包括补加的水）加大到 0.5ml或1.0ml,空白对照则分别为 0.5ml或1.0mlH2O,考马斯亮蓝G 250试剂仍加5.0ml,同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。RGFUB50.05mg牛血清蛋白/ml溶液的 A595约为0.29。W0 % G­x二、紫外吸收法 N1HF1l*优点：1 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。2低浓度的盐，例如生化制备中常用的（ NH4 2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。缺点：1 测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋

15、白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大 的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。2 若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰虽然可以适当的校正，但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。fVr）CI >Q93进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的 pH 相一致。 H（一） 280nm 的光吸收法 M$因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸

16、的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。%'Zu!h'6A测定：将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中， 用配制蛋白质溶液的溶剂 （水或缓冲液） 作空白对照， 在紫外分光度计上直接读取 280nm 的吸光度值 A280。注意事项：1蛋白质浓度可控制在 0.11.0mg/ml左右。2 通常用 1cm 光径的标准石英比色皿，盛有浓度为 1mg/ml 的蛋白质溶液时， A280 约为 1.0 左右。由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。 ;l*=&A（二） 280nm和260nm的吸收差法核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强

17、10倍(每克)，但核酸在 260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近核酸260nm处的消光系数是 280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：纯蛋白质的光吸收比值： A280/A260= 1.8 :Ds=#w 2:纯核酸的光吸收比值： A280/A260 = 0.5 ;Scf %t_测定：含有核酸的样品蛋白质溶液，可分别测定其 A280和A260，由此吸收差值，用下面的经验公式，即可算出蛋白质的浓度。？1'+蛋白质浓度(mg/ml)=1.45 XA280-0.74 XA260 4g npIO-w三 BCA 法蛋白定量1原理：BCA(bi

18、cinchoninic acid)是理想的蛋白质定量方法。碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+, Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物,测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。2 特点：(1) BCA 法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS， Triton X-100 ， Tween不影响检测结果，但螯合剂(EDTA EGTA)还原剂(DTT,巯基乙醇)和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂 解液本身背景值较高，可试用 Bradford 法测定蛋白浓度。准确灵敏，线性范围广：BCA试剂的蛋白质测定范围是102000µg/ml。(3) 经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。3 材料BCA A 液：pH 11.25 ，1% N a2BCA （二锌可宁酸钠），2% Na2CO3 H2Q 0.16% Na2 Tartrate ，0.4% NaOH, 0.95% NaHCO3