抗－HEV单克隆抗体B4C重链可变区基因的克隆及初步表达

1、    抗HEV单克隆抗体B4C重链可变区基因的克隆及初步表达*        关键词HEV单克隆抗体重链可变区克隆表达摘要抗HEV87A株单克隆抗体（mAb）B4C经体外研究鉴定，证实对我国暴发和散发性HEV毒株有很高的特异性。为从分子水平上了解mAbB4C，我们利用基因工程技术，从杂交瘤细胞系中克隆出了重链可变区基因，并对其全部核苷酸序列进行了分析，可能属于小鼠免疫球蛋白重链IA亚组。将VHcDNA克隆到高效表达载体pQE31中，经IPTG诱导，SDSPAGE分析，可见1

2、条Mr为16000左右的表达带，表达产物占菌体总蛋白的29.3，主要以包涵体形式存在。中国书资料分类号Q78Cloning and expression of a heavy chain variable region of mAb B4C against HEV Geng Liqing，Liu Minxia，Yuan Xitong，Li Xiaoyu，Huang Rutong，Li Derong(Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850) K

3、eywords HEV mAb heavy chain variable region cloning expression Abstract The monoclonal antibody B4C against HEV strain 87A was proved to be specific to chinese strains of the epidemic and sporadic HEV. The gene of heavy chain variable region was amplified from the hybridoma cells and cloned for sequ

4、ence analysis. It appeared to be in the subgroup IA of mouse immunoglobulin VH. While the VH gene was cloned into a highly expressive vector pQE31 and induced by IPTG, a recombinant protein about 16 000(Mr) was detected by SDSPAGE. The yield was up to 29.3 of the total amount of bacteria protein and

5、 the product was mostly in the form of inclusion bodies. 尽管第二代抗体（mAb）的出现，对生物学与医学的发展起了巨大的推动作用，但由于人源性mAb的制备技术尚不完善，来源很困难，目前临床上诊断、治疗用的多为鼠源性mAb，用于人体常常可引起人抗鼠mAb的免疫排斥反应，严重影响使用效果。近年来随着生物工程技术的飞速发展，人们对已有的鼠源性mAb进行改造，研制出单链抗体、Fab段、嵌合抗体及重构抗体等一系列基因工程抗体，试解决mAb在治疗中的免疫排斥反应问题。我们将本实验室研制的具有良好活性的抗?HEVmAbB4C，经RTPCR法扩增出重链可

6、变区基因，进行克隆、测序，并在大肠杆菌中得到高效表达，为进一步研制小分子抗体和嵌合抗体打下基础。1材料和方法1.1细胞株、质粒及菌株分泌抗HEV87A株mAb的杂交瘤细胞B4C,是由本实验室所建立1。pGEMTEasy克隆载体，为Promega公司产品。表达载体pQE31及宿主菌M15，由本所周育森博士惠赠。1.2细胞总RNA提取及cDNA合成采用酸性异硫氰酸胍酚氯仿一步法2，从8×106B4C杂交瘤细胞中提取总RNA，取10g作模板，以1loligo(dT)16(50mol/L)作为反向引物反转录合成cDNA。1.3PCR扩增VH基因在50l反应体系中，加入10×PCR缓

7、冲液5l，0.2mmol/LdNTP,VH上、下游引物各10pmol/L，cDNA5l，TaqDNA聚合酶2.5U，混匀后，液面加石蜡油封闭进行循环反应。循环参数为：94变性1min，55退火1min,72延伸1.5min,反应30个循环，末次循环在72保温10min。PCR产物用1.5琼脂糖凝胶电泳观察。1.4VH基因的PCR产物的克隆VH基因的PCR产物经低融点琼脂糖凝胶回收纯化后，与载体片段按克分子比31（mol/mol)的比例，在T4DNA连接酶催化下，于4连接过夜，转化E.coliJM109感受态细胞，在Xgal和IPTG显色标志下，置37孵育12h16h。筛选白色菌落，以碱裂解法提

8、取重组质粒，经NotI单酶消化鉴定。1.5核苷酸序列的测定将鉴定为阳性的重组子pGEMTEasyVH质粒，纯化后采用双脱氧核苷酸链末端终止法进行序列测定（由北京市朝阳医院临床分子生物学实验室协助测定）。1.6重组表达质粒的构建将酶切鉴定为正向插入的测序质粒pGEMTEasyVH7,由PstI单酶切回收386bp的片段，并与PstI单酶切去除5P的pQE31载体连接，转化M15大肠杆菌，筛选正向插入的克隆，作为已构建好的pQE31VH表达质粒。1.7大肠杆菌重组蛋白的诱导表达将含重组表达质粒pQE31VH的单个菌落接种于含抗生素的LB培养基中，37活化过夜。次日将1菌液转种于2mlLB培养基中，

9、37振摇至A600=0.40.6。加入IPTG至终浓度为12mmol/L,37诱导3h5h。取1ml诱导表达菌液离心，回收菌体沉淀，以50l凝胶加样缓冲液悬浮，煮沸5min，离心后取20l上清进行15SDSPAGE，以考马斯亮兰染色。2结果2.1B4C VH基因的PCR扩增及克隆鉴定扩增VH基因的引物根据小鼠IgVH基因相对保守的框架区FR1和FR4序列而设计。VH上游引物：（50nt）5GGCGGTGGCGGCTCGGGTGGAGGCGGATCTGT(CG)(AC) A(AG) CTGCAG (CG) AGTC(AT)GG3。VH基因下游引物：（39nt）5CGGGATCCGGAGACGGT

10、GACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG3。VH基因上游引物中，前30个碱基是为构建ScFv与VL基因下游互补形成连接肽Linker而设计的。经30个循环PCR扩增后，得到大约390bp大小的清晰条带（1）。将B4CVH基因PCR产物（约390bp的片段）快速克隆到pGEM?TEasy载体中。因载体上插入片段的两端各有1个NotI位点，因此，经NotI单酶消化后，VH重组子可得到3.0kb载体片段和420bp左右的插入片段。用PCR方法也可从VH重组子中扩增出390bp片段，表明PCR产物已成功地克隆到载体pGEMTEasy中（2）。1B4C重链可变区基因的PCR扩增Fig 1 PCR a

11、mplification of B4C VH gene A:PCR product of VH gene; B:pBR322/Hinf I marker 2重组测序质粒pGEMTEasyVH的鉴定Fig 2 Identification of recombinant plasmid pGEMTEasyVH A:pBR322/Hinf I marker; B:PCR product of VH from pGEMTEasyVH;C:pGEMTEasyVH/Not I;D:PGEMTEasy/Not I; E: DNA/EcoR IHind III marker 2.2B4CVH核苷酸序列的测定用

12、双脱氧核苷酸链末端终止法自动测序，获得VH基因为357bp的核苷酸序列。通过与BLASTN和Kabat数据库中相关基因比较，该mAbB4CVH基因与TF5139新生小鼠脾细胞Ig基因的同源性达91，可能属于小鼠重链可变区第IA亚组（3）。VH基因编码119个氨基酸，包括3个互补决定区（CDRs）和4个框架区（FRs）。第22位和92位均为Cys，可形成二硫键；第104位和106位均为Gly，完全符合鼠源性抗体VH基因的特征。3重链可变区基因的核苷酸序列及相应的氨基酸序列Fig 3 Nucleotide and corresponding amino acid sequences of VH g

13、eneNote: Bold face letters in italics represent sequence of primers 2.3B4CVH基因在大肠杆菌中的表达根据测序结果，pGEMTEasyVH中VH基因第4、5位氨基酸6个碱基恰是PstI限制酶切位点，且多克隆位点下游处也有1个PstI位点。PstI酶切后，获得386bp的片段，证明VH基因为正向克隆。将此片段与PstI酶切并去除5P的载体pQE31连接（4），转化大肠杆菌M15，取菌落PCR阳性的重组子，经PstI单酶切可切出386bp的片段，证明该质粒为正向克隆的表达重组质粒（5）。重组质粒pQE31VH在2mmol/LI

14、PTG的诱导下，于37诱导5h，取菌体进行SDSPAGE。结果显示，在Mr为16000左右有1条很浓的蛋白带，而诱导的空载体菌则无此带。将分离的表达菌的周质、胞浆及包涵体进行SDSPAGE，并将表达蛋白在细胞内定位。结果显示，表达产物主要以包涵体的形式存在，只有极少量蛋白为可溶性的蛋白（6）。通过对脱色后的凝胶薄层扫描，测出重组VH单域抗体蛋白占全菌总蛋白的29.3，Mr为167000，与理论估计值相一致。4重组表达质粒pQE31VH的构建（示意）Fig 4 Construction of recombinant expression plasmid pQE31VH 5重组表达质粒pQE31V

15、H的鉴定Fig 5 Identification of recombinant expression plasmid pQE31VH A: DNA/EcoRI Hind III marker; B:pQE31/PstI; C:pQE31VH/PstI; D:PCR product of pQE31VH; E:pBR322/HinfI marker6 pQE31VH表达产物的 SDSPAGE分析Fig 6 SDSPAGE analysis of expression product of pQE31VH A:Low molecular weight protein marker; B:Induc

16、ed M15/pQE31; C:Total bacteria of induced M15/pQE31VH; DF:Periplasm, supernatant and inclusion body of induced M15/pQE31VH 3讨论本研究利用PCR技术，从抗HEVmAbB4C杂交瘤细胞cDNA中，直接扩增VH基因，克隆并测定了全部核苷酸序列。目前，研制基因工程抗体的首要条件是，PCR扩增mAb的可变区和恒定区基因，其引物大多是根据Kabat3的免疫球蛋白数据库信息而设计的。我们扩增抗HEVmAbVH基因所采用引物，是根据Orlandi等4发表的针对FR1和FR4设计的简并引

17、物，很容易地扩增出VH390bp的VH基因片段，证明该引物比较适合我们的mAbB4C。但由于目前已知的抗体基因数目有限，设计的引物并非都能够扩增出所有的抗体基因，这有待于人们进一步发现更多的抗体基因，掌握其规律，以设计出更加完美的引物。近年来，基因工程抗体的表达已不仅仅局限于淋巴细胞、骨髓瘤细胞、酵母、哺乳动物和昆虫等非淋巴细胞，大肠杆菌甚至植物细胞都已成功地表达出有功能性的抗体分子。由于大肠杆菌表达异源性蛋白易于操作，成本较低，并可进行随机诱变构建文库，因而得到了广泛的应用。我们采用的pQE31原核高效表达载体，含有优化的噬菌体T5启动子和2个Lac操纵子，在IPTG诱导下，插入外源基因的表

18、达载体在大肠杆菌M15中，可高水平地表达N端含6×His亲和尾的蛋白，并可通过特有的Ni?NTA树脂吸附6×His尾进行纯化。将PstI单酶切回收的VH基因的386bp片段重组入pQE31PstI位点，转化M15宿主菌，经2mmol/LIPTG诱导，可高效表达重组蛋白（Mr为16000左右）。表达量占全菌蛋白的29.3，主要以不溶性的包涵体形式存在。抗HEVmAbVH基因的克隆、表达成功，为将来进一步设计构建各种类型的基因工程抗体打下了基础。*总后指令性课题，NO.9608037作者简介：耿丽卿，女，26岁，硕士北京市海淀区太平路27号，Tel:(010)66931535作者单位：耿丽卿刘敏霞苑锡同李晓萸黄如统李德荣（军事医学科学院微生物学流行病学研究所，北京100850）参考文献1耿丽卿，刘敏霞，苑锡同，等.分泌抗戊型肝炎病毒（HEV）单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立.军事医学科学院院刊，1997；21（4）：31?2Chomczynski P, Sacchi N. Single? step method of RNA isolation by acid guanidinium? thiocyanate? phenol? chloroform extraction. Anal Biochem, 1987; 162:156 159 3Kabat EA