抗黄曲霉毒素M1抗体制备及检测方法建立

1、抗黄曲霉毒素M1抗体制备及检测方法建立    【关键词】  黄曲霉毒素M1；单克隆抗体；酶联免疫吸附试验摘要： 目的   制备针对黄曲霉毒素M1的单克隆抗体并建立针对黄曲霉毒素M1的间接竞争酶联免疫吸附试验检测方法。方法   利用B细胞杂交瘤技术，建立能分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，建立间接竞争酶联免疫吸附试验检测方法。结果   研制出1株能特异性分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2F2。该单克隆抗体的Ig亚类为IgG1

2、，亲和常数为28×10-11mol/L。该抗体与黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2和黄曲霉毒素M2等结构类似物有微弱的交叉反应，具有较高的特异性。在此基础上建立了间接竞争酶联免疫吸附试验检测方法。该方法的最低检出浓度为007ng/ml，校正曲线的线性范围为0022ng/ml，线性方程y=-04364x+02693(R2=09949)。方法的加标回收率为725%1313%。结论   制备了具有高特异性和亲和力的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，并建立了快速、灵敏的针对黄曲霉毒素M1的酶联免疫吸附试验检测方法。关键词： 黄曲霉毒素M1；单克隆抗体

3、；酶联免疫吸附试验Development of monoclonal antibody against aflatoxin M1 and immunoassay for aflatoxin M1   Abstract： Objective   To prepare monoclonal antibody against aflatoxin M1 and develop indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of aflatoxin M1.Methods&#

4、160;  Hybridoma cell line excreting monoclonal antibody against aflatoxin M1 was produced using B cell hybridoma technique and develop indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of aflatoxin M1.Results   One hybridoma cell line excreting monoclonal antibodies

5、 against aflatoxin M1 coded 2F2 was obtained by fusing murine Sp2/0 cells with spleen cells from BALB/c mice immunized with AFM1-BSA conjugate.The monoclonal antibody produced by the hybridoma cell were tested for subtype and designated as IgG1 for 2F2.The affinity of IgG in purified ascites yielded

6、 by hybridoma cell was 28×10-11 mol/L.The monoclonal antibody obtained in the present study was specific to aflatoxin M1,because of lightly cross reactions among the monoclonal antibodies against aflatoxin M1 with the analogues of aflatoxin B1,aflatoxin B2,aflatoxin G1,aflatoxin G2 and aflatoxi

7、n M2 were found.The limit of detecting concentration of aflatoxin M1 was 0.07 ng/ml.The linear range of standard curve was 0022ng/ml and the linear equation was y=-04364x+02693(R2=0.9949).The recovery of aflatoxin M1 was between 725%1313%.Conclusion   The monoclonal antibody obtained in th

8、e study was of relatively high specificity to aflatoxin M1,and a simple fast sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of aflatoxin M1 was developed.Key words： aflatoxin M1;monoclonal antibody;enzyme-linked immunosorbect assay      黄曲

9、霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)是动物摄入黄曲霉毒素B1(AFB1)后在体内经羟基化代谢的产物，存在于动物体内可食部分，如乳、肝、蛋类等，其中以乳最为常见，且乳与乳制品中的AFM1在生产和贮藏期间相对稳定，巴氏消毒难以破坏1。AFM1的急性毒性与AFB1大致相同，可引起实验动物发生肿瘤2，50g/(kgbw)的AFM1可致大鼠肝癌及结肠腺癌3，此外尚有AFM1引起牙原性肿瘤的报道4。鉴于AFM1对人类健康构成潜在的威胁，在我国食用乳与乳制品者又多为婴幼儿、老年人和体弱多病者，因此，必须对其含量进行监控，限制AFM1在牛奶或乳制品中的污染水平，达到保护消费者健康的目的。因此，建立

10、精确、简便、快速、灵敏、回收率高、不需特殊设备和可在基层实验室开展的检测分析方法十分必要。本文旨在制备抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，并对抗体特性进行鉴定，为进一步研制具有我国自主知识产权的免疫学快速检测试剂盒提供技术支持。1   材料与方法11   材料111   器材   CO2培养箱(美国Queue公司)；洁净工作台(北京半导体设备一厂)；生物倒置显微镜(日本欧林巴斯光学株式会社)；酶标分析仪(瑞士SUNRISE公司)；电子分析天平(瑞士Mettler公司)；低温高速离心机(德国Hermle公司)；普通离心机(北

11、京医用离心机厂)；电泳仪(美国BIORAD公司)；微量可调移液器(法国Gilson公司)；细胞培养板(96孔(美国Costar公司)；24孔(美国Gibco公司)；酶标板(96孔，美国Corning公司)。112   试剂   黄曲霉毒素M1，黄曲霉毒素M1-BSA偶联物(AFM1-BSA)、牛血清白蛋白(BSA)、抗体亚类测定试剂盒(IgM,IgG,IgA,IgD,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3)、黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1)、黄曲霉毒素B2(Aflatoxin B2)、黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1)和黄曲霉毒素G

12、2(Aflatoxin G2)(美国Sigma公司)。RPMI 1640培养基，选择性培养基，福氏佐剂(完全、不完全)、二甲基亚砜(DMSO)，3,3,5,5四甲基联苯氨(TMB)、吐温20(Tween 20)、聚乙二醇(PEG，MW 4000)、青霉素、链霉素(美国Gibco公司)；辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山试剂公司)；30%H2O2(优级纯，北京化工厂)；二甲基甲酰胺、过碘酸钠、辛酸、硼氢化钠、无水乙醇、乙醚、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、氢氧化铵、硫酸铵、氢氧化钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸钠等，均为分析纯以上(北京化学试剂商店)。113 

13、;  溶液系统   参考文献5制备。114   细胞系与实验动物   小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0由本室传代，并经8氮杂鸟嘌呤处理。雌性BALB/c小鼠，体重1820g(军事医学科学院实验动物研究所动物繁育场)。12   方法121   免疫动物   采用小剂量长周期的免疫方案。对68周龄的雌性BALB/c小鼠，体重1820g，首次免疫用100g黄曲霉毒素M1-小牛血清白蛋白(BSA)与等量完全福氏佐剂混匀，腹腔注射。2周后，用50g黄曲霉毒素M1-BSA与等量不完全

14、福氏佐剂混匀后，腹腔注射。此后每隔2周用50g黄曲霉毒素M1-BSA与等量不完全福氏佐剂混匀，腹腔注射。8周后脾内免疫50g黄曲霉毒素M1-BSA作为加强免疫，3d后取脾细胞进行融合。122   细胞融合   免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(Sp2/0)以101混合，用50%聚乙二醇(PEG)作融合剂。融合细胞悬于含20%小牛血清的选择培养基内，分种于加有BALB/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，置5%CO2,37孵箱中培养，当镜检杂交瘤克隆生长达1/31/2视野时，取上清进行筛选。123   杂交瘤筛选及抗体检测&#

15、160;  以黄曲霉毒素M1-BSA为包被抗原，用间接非竞争ELISA法筛选分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的细胞孔，用黄曲霉毒素M1间接竞争抑制性ELISA法确证。以免疫小鼠的血清为阳性对照，以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照，以细胞培养板中未长出克隆的细胞培养上清为阴性对照，阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)/(A对照-A空白)21。百事通 124   杂交瘤细胞克隆化   采用培养瓶内准确计数稀释法8。当连续3次100%阳性，即可将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中。125   单克隆抗体的生产   采用动

16、物体内诱生单克隆抗体的方法6。126   单克隆抗体的纯化   采用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化7。13   单克隆抗体的鉴定   抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用抗体亚类测定试剂盒进行测定。抗体IgG含量采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白测定试剂盒进行测定。抗体分子量采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法8。抗体滴度测定以黄曲霉毒素M1-BSA为包被抗原，从110000开始将抗体进行倍比稀释，以Sp2/0细胞培养上清为阴性对照，用间接非竞争ELISA方法测定抗体滴度，以(A试验-A空白)/(A对照

17、-A空白)21的最大稀释倍数为滴定终点。抗体亲和力的测定采用间接非竞争性ELISA法，即测定抗体的亲和常数9。抗体的特异性和抗体的灵敏度用间接竞争抑制性ELISA法进行测定，参试毒素为黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B2，黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2和黄曲霉毒素M2。14   样品提取   按照国家标准方法提取10。15   黄曲霉毒素M1间接竞争抑制性酶联免疫吸附试验检测方法   试验条件的最佳组合用棋盘滴定法确定。(1)用黄曲霉毒素M1-牛血清白蛋白连接物(00625ng/ml)包被酶标微孔板，每孔100l，4过夜

18、；(2)酶标板加入不同浓度的黄曲霉毒素M1标准溶液或样品提取液和单克隆抗体溶液的混合液100l(该混合液为毒素标准溶液或样品提取液与单克隆抗体溶液按11混合，提前混合好，4过夜)，37 1h；(3)酶标板加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，每孔100l，37 1h；(4)酶标板加底物溶液，每孔100l，37 30min；(5)每孔加入终止液50l，于450nm处测定吸光度值(A)。(6)计算：黄曲霉毒素M1含量(ng/g)=C*V1*V2*X/(W*V3)。式中：C为酶标板上测得的黄曲霉毒素M1浓度(ng/ml)，根据标准曲线求得；V1为样品提取液的总体积(ml)；V2为定容样液的体积(ml)

19、；V3为取出的样品液的体积(ml)；X为样品提取液的稀释倍数；W为样品的重量(g)。2   结果21   单克隆抗体的制备   用黄曲霉毒素M1-BSA免疫BALB/c小鼠获得了较好的免疫应答。细胞融合后，经间接非竞争ELISA方法筛选，并用间接竞争ELISA方法确证，从中选择出对黄曲霉毒素M1毒素有强抑制而阳性对照孔较强的细胞株，经34次亚克隆，达到3次100%阳性，建立了1株稳定分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2F2。22   单克隆抗体特性的鉴定   抗黄曲霉毒素M1抗

20、体亚类是IgG1，相对分子量是150KD，抗体的亲和力常数是28×10-11 mol/L。抗体与黄曲霉毒素B1的交叉反应率是155%，抗体与黄曲霉毒素G1的交叉反应率是39%，抗体与黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M2和牛血清白蛋白的交叉反应率均<1%。23   黄曲霉毒素M1标准品校正曲线   用20%甲醇-磷酸盐缓冲液将黄曲霉毒素M1配成不同浓度标准使用液(0,001,002,005,010,020,050,100,200,500,1000ng/ml)，将抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体按照1106稀释，用间接竞争抑制性酶联免疫吸

21、附试验法测得校正曲线，线性范围是0022ng/ml，线性方程是y=-04364x+02693(R2=09949)。最低检出浓度为007ng/ml。24   加标回收试验   从市场上购买鲜奶和奶粉，分别进行05g/kg和10g/kg加标回收试验。对鲜奶样品的平均加标回收率分别为(1125±96)%和(877±198)%，对奶粉的加标回收率分别为(1197±156)%和(1086±147)%，对各样品的加标回收率范围为725%1313%。3   讨论在本研究中所制备的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，对

22、黄曲霉毒素M1具有高灵敏度和高特异性，可用于建立检测乳与乳制品中AFM1污染水平的免疫学检测方法，以期达到对各种奶制品开展大规模调查，了解我国奶和奶制品中黄曲霉毒素的污染水平。关于抗体的特异性，本研究选择了黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M2和牛血清白蛋白进行交叉反应。由于黄曲霉毒素在自然界中有许多衍生物，其结构极其相似，建立在多克隆抗体基础上的AFM1检测方法多与其他黄曲霉毒素发生交叉反应，而使其应用价值降低11。本研究在对抗黄曲霉毒素M1杂交瘤细胞株大量筛选的基础上，得到了1株能分泌抗AFM1的杂交瘤细胞株2F2，用该细胞株生产的抗体仅与黄曲霉毒素

23、B1和黄曲霉毒素G1有微弱的交叉反应，与其他黄曲霉毒素的衍生物和牛血清白蛋白无交叉反应。由于黄曲霉毒素M1是污染奶和奶制品的主要组分，因此，采用2F2抗体建立的ELISA方法可以确保对黄曲霉毒素M1具有高度的特异性，不会影响黄曲霉毒素M1ELISA试剂盒的实际应用。本研究成功地筛选出能够分泌抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体杂交瘤细胞株，制备出对黄曲霉毒素M1具有高亲合力、高特异性的单克隆抗体，并建立了快速、灵敏的检测鲜奶及奶粉中黄曲霉毒素M1污染水平的酶联免疫吸附试验检测方法，为鲜奶及奶粉的快速筛检提供了技术支持。参考文献1   DP Heish,Cullen JM,Hsieh

24、 LS,et al.Cancer risks posed by aflatoxin M1J.Princess Takamatsu Symp，1985,16:57-65.2   Cusumano V,Costa GB,Trifiletti R,et al.Functional impairment of rat Kupffer cells induced by aflatoxin B and its metabolitesJ.FEMS-Immunological Medi-MIcrobiology,1995,10(2):151-155.3   Yoshizawa T,Yamashita A,Luo Y.Fumonisin occurrence in corn from high and low risk areas for human esophageal cancer in ChinaJ.Appl Environ Microbiol,1994,60(5):1626-1629.4   Sydenham EW,Thiel