慢性丙型肝炎患者HCVHVR1准种异质性与干扰素疗效关系的研究①

1、慢性丙型肝炎患者HCV HVR1准种异质性与干扰素疗效关系的研究石理兰 张 琳 赵桂珍 冯国和 马 力 （中国医科大学附属第二医院感染科，沈阳110004）中国图书分类号 R512. 63 文献标识码 A 文章编号 1000-484X （2005）09-0714-05摘 要 目的：研究HCV HVR1准种异质性与干扰素疗效以及与HCV RNA 载量之间的关系，为临床选择应用干扰素抗病毒治疗适应症及预测疗效提供理论依据。方法：采用核苷酸序列测定法进行HCV 基因分型；分别采用单链构象多态性聚合酶链反应法（SSCP ）及克隆测序法进行HVR1准种异质性检测；采用荧光特异性PCR 法进行HCV RN

2、A 载量检测。结果：14例1b 型慢性丙肝患者干扰素治疗前5例为SSCP 低复杂性（SSCP 条带数+3），9例为高复杂性（SSCP 条带数>3），干扰素治疗应答组SSCP 条带数明显少于无应答组。1b 型患者中无应答组HVR1变异株的数目（准种数）和基因的差异性（每个基因位点的平均变异率）均明显高于应答组。HVR1准种异质性程度与HCV RNA 含量无正相关关系。结论：感染HCV 基因型1b 型的慢性丙型肝炎患者HVR1准种异质性程度越高对干扰素无应答的可能性越大。HVR1准种的复杂性程度与HCV RNA 含量无关，是预测干扰素疗效的一个独立因素。关键词丙型肝炎病毒；高变区1；准种；干

3、扰素治疗The relationship between the heterogeneity of HCV HVR1quasispecies and the ef-fectiveness of IFN therapy in patients with chronic hepatitis CSHI Li-Lan ，ZHANG Lin ，ZHAO Gui-Zhen ，FENG Guo-He ，MA Li. Department of Infectious Disease ，The Second Clinical College ，China Medical University ，Shenyang

4、 110004，ChinaAbstract Objective ：To study the relationship between the heterogeneity of HCV HVR1quasispecies and the effectiveness of IFN therapy and HCV RNA level. Methods ：The HVR1quasispecies heterogeneity was detected by polymerase chain reaction-mediated single-strand conformation polymorphism

5、（SSCP ）and cloning and sequencing. HCV RNA level was detected using the method of specified fluorogence probe PCR. Results ：Among 14patients infected with HCV 1b ，5showed low complexity （SSCP band numbers +3），9showed high complexity （SSCP band numbers >3）. The SSCP bands were more in non-response

6、 group than those in response group. The numbers and the nucleotide diversity of HVR1quasispecies in the non-response of group were significantly higher than those in the response of group. There were no correlation between the complexity of HVR1quasispecies and HCV RNA level. Conclusion ：The higher

7、 heterogeneity of HVR1quasispecies may lead to non-response to IFN therapy. The complexity of HVR1quasispecies was an independent predicting fac-tor for the effectiveness of IFN therapy.Key words HCV ；HVR1；Quasispecies ；IFNHCV 基因组具有高度的变异性1，2，尤以E2/NS1区内高变区1（HVR1）变异程度最高，通常以HVR1准种的异质性程度代表整个HCV 基因组的异质性3

8、。近年研究发现，HCV 准种特点不仅与HCV感染慢性化有关，还与HCV 对IFN 治疗的应答密切相关。该研究分别采用单链构象多态性聚合酶链反应法（SSCP ）及克隆测序法对14例1b 型应用IFN 治疗的慢性丙型肝炎患者进行了HVR1准种异质性检测，以探讨HCV 准种感染与干扰素疗效的关系。1 材料与方法1. 1 研究对象 应用干扰素治疗的慢性丙型肝炎本课题为辽宁省教育厅资助项目（202013120）作者简介：石理兰（1954年-），女，副教授，硕士生导师，主要从事病毒性肝炎治疗的研究。患者共18例，男14例，女4例。年龄2345岁。干扰素治疗方案：-2a 干扰素（罗扰素瑞士罗氏公司生产）3M

9、U ，每周3次肌肉注射，共24周。并对患者进行跟踪随访。疗效判定：治疗结束时，ALT 正常、HCV RNA 阴转并持续至6个月以上为有效。否则为无效。分别于治疗前、治疗后3个月、6个月留取血清，-70冻存备用。1. 2 方法1. 2. 1 HCV 基因分型 按照Simmonds 的分型方法，采用基因序列测定法，依据NS5A 区核苷酸序列进行基因分型。依据NS5A 两侧保守区设计PCR 引物，应用RT-PCR 法扩增NS5A 基因片段，PCR 产物直接进行核苷酸序列测定，应用Bioedit 软件进行基因亲缘关系分析（基因树）。引物序列如下：外引物1：5'-TTGGCCAGCTCTTCAG

10、CTAGC-3' （核苷酸位置69216936）；外引物2：5'-CCAGGACTCTAGCAGTG417中国免疫学杂志2005年第21卷GAC-3' （核苷酸位置72117232）；内引物1：5'-TCAGCTAGCCAATTGTCTGC-3' （核苷酸位置69336952）；内引物2：5'-CAGTGGAGGGTGTGGAGGGTCT G-3' （核苷酸位置72007220）。NS5A 基因片段大小为573bp （图1）。1. 2. 2 HVR1基因片段扩增 常规方法从血清中提取HCV RNA 后，应用RT-PCR 法扩增HVR1基因

11、片段。引物序列为：外引物1：5'-CTACTCCGGATCCCA-CAAGC-3' （核苷酸位置10091028）；外引物2：5'-GGGCTCGGAGTGAAGCAATA-3' （核苷酸位置15191538）；内引物1：5'-ATTCCATGGTGGGGAACTGG-3' （核苷酸位置10851104）；内引物2：5'-GCAAT-ACACTGGACCACACA-3' （核苷酸位置15041523）。具体步骤见文献4。HVR1基因片段大小为388bp （图1）。1. 2. 3 SSCP 法检测HVR1准种复杂性 取PCR 产物1

12、0µl ，加变性上样液（去离子甲酰胺、0. 05%溴酚蓝及2%甘油）10µl ，进行9610分钟预变性，取出后立即放入冰浴中，之后进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（300V ，5小时），胶取出后用10%乙醇加0. 5%冰乙酸进行固定20分钟，洗涤后用0. 2%硝酸银染色20分钟，之后用1. 5%NaOH 加0. 4%甲醛显色，肉眼观察至显带为止，用10%冰乙酸进行终止。将结果存入电脑。1. 2. 4 克隆测序法检测HVR1准种异质性1. 2. 4. 1 PCR 产物纯化 按试剂盒（QIAGEN 公司产品）说明书进行。1. 2. 4. 2 重组质粒的构建、转化与鉴定 按照PCR 产

13、物克隆试剂盒（QIAGEN 公司产品）说明书，将已纯化的PCR 产物与载体质粒pDrive Cloning Vector 连图1 RT-PCR 扩增HVR1和NS5A 基因片段电泳结果Fig. 1 Electrophoresis results of HVR1and NS5A amplifiedby RT-PCRNote ：M. Molecular mark pGEM-32f （+）/Hae DNA asreference ；1，2. HVR1frengment ；3，4. NS5A frengement.接后，转化至感受态大肠杆菌EZ Competent Cells ，经LB 琼脂培养皿（A

14、mpicillin 100µg /ml ，IPTG 120µg /ml ，X-ga 180µg /ml ）培养筛选出阳性菌落，分别挑取单个菌落接种于2ml LB 培养基中（Ampicillin 100µg /ml ）扩增培养。碱裂解法提取重组质粒。应用酶切法进行鉴定。1. 2. 4. 3 重组质粒的核苷酸序列测定 由上海联合基因公司完成。结果应用Bioedit 软件进行分析。1. 2. 5 HCV RNA 含量检测 采用特异性荧光探针PCR 法进行血清HCV RNA 含量检测，按试剂盒（深圳匹基生物技术开发有限公司产品）说明书进行。2 结果2. 1 HC

15、V 基因分型结果 对18例患者依据NS5A 区核苷酸序列进行基因分型的结果为14例为1b 型，1例为1c 型，3例为2a 型，各序列在基因树中的位置，见图2。2. 2 HVR1准种的异质性与IFN 疗效的关系2. 2. 1 SSCP 检测结果 18例患者中，对其中14例1b 型患者进行了HVR1准种复杂性检测，干扰素治疗前5例（35. 7%）为SSCP 低复杂性（SSCP 条带数+3），9例（64. 3%）为高复杂性（SSCP 条带数>3）。干扰素治疗3个月时，3例（21. 4%）患者血清ALT 正常、HCV RNA 阴转，均发生在低复杂性组，其余大部分患者SSCP 条带数减少12条带。

16、治疗6个月时，6例（42. 9%）患者血清ALT 正常、HCV RNA 阴转，仅2例发生在高复杂性组。8例无应答者中4例SSCP 条带数均有所减少、2例无变化、2例较治疗前有所增加。应答组与无应答组HVR1准种复杂性的比较见表1，HVR1准种复杂性与HCV RNA 阴转率的关系见表2。图2 应用直接测序法进行基因分型结果Fig. 2 Genotype classification by direct sequencing517石理兰等 慢性丙型肝炎患者HCV HVR1准种异质性与干扰素疗效关系的研究 第9 期表1 1b 型患者HVR1准种复杂性与干扰素疗效的关系Tab. 1 Relations

17、hip of the complexity of HVR1quasispeciesand the effectiveness of IFN therapyGroups n SSCP bands before therapyP valueResponders 62. 429±1. 272Non-responders84. 182±0. 874<0. 05表2 HVR1准种复杂性与HCV RNA 阴转率的关系Tab. 2 Relationship between the complexity of HVR1qua-sispecies and the negative ra

18、te of HCV RNAGroups n HCV RNA negative HCV RNA negative（%）P valueLow complexity 5480High complexity9222. 2<0. 05表3 应用克隆测序法检测7例1b 型患者HVR1区的准种数Tab. 3 Numbers of HVR1quasispecies of 7patients infectedwith genotype 1b by the method of cloning and se-quencingPatients Clones （n ）Quasispecies （n ）Respon

19、ders 286Non-responders35251）Note ：Comparison to responder patients ，1）P <0. 01.表4 干扰素治疗有效组和无效组基因差异性的比较Tab. 4 Comparison of the genomic diversity between re-sponders and nonrespondersGroups Nt mutant rate /position Aa mutant rate /position Responders 1. 146×10-24. 156×10-2Non-responders3

20、. 563×10-27. 625×10-21）Note ：Comparison to responder patients ，1）P <0. 01.表5 HCV 准种复杂性与HCV RNA 含量的关系Tab. 5 Relationship of HCV quasispecies complexity andHCV RNA levelPatients Clones （n ）Quasispecies （n ）HCV RNA level1916. 95×1042932. 19×10431021. 59×1064652. 99×1055

21、962. 24×10561083. 59×10671064. 20×106Note ：r =0. 432，P >0. 05.2. 2. 2 克隆测序检测结果 对上述7例患者进行了HVR1区克隆测序，其中3例为应答者、4例为无应答者。每份血清挑取10个阳性克隆，共获得了63个克隆的序列。HVR1准种的复杂性（准种数）无效组明显高于有效组（t =6. 737，P <0. 01），见表3。HVR1准种基因的差异性（nucleotide diversity ）以每个基因位点的平均变异率来表示。无效组平均每个位点的核苷酸及氨基酸变异率均明显高于有效组，见表4。2

22、. 3 HCV 准种复杂性与HCV RNA 含量的关系 HVR1SSCP 高复杂性组HCV RNA 含量与低复杂性组相比有增高趋势，但统计学检测无显著差异，见表5。3 讨论基因型1b 型HCV 感染及治疗前高病毒载量是导致IFN 疗效低下的重要因素5，6。我国慢性丙型肝炎患者中HCV 的基因型主要是1b 型7，8。本研究结果中，HCV 1b 型占77. 8%表明沈阳地区HCV 感染也以1b 型为主。但即使基因型完全相同、HCV RNA 含量相似的病人，对IFN 的应答结果可截然不同，提示尚有其他因素影响对IFN 的应答。近年的研究表明，HCV 准种的异质性（包括复杂性与基因的差异性）也是影响I

23、FN 疗效的重要因素之一。Morib 和Guen 等9，10的研究发现，慢性丙型肝炎患者HVR1准种复杂性程度越高对IFN 治疗无应答的可能性越大。Polyak 等11认为，准种的复杂性（变异株数目）和基因的差异性（变异株差异）是相关的，但差异性与IFN 疗效关系更为密切，可用于疗效预测，复杂性则不能作为预测因素。Sandres 等12则报道，HVR1准种的复杂性和差异性都与病毒的清除无关，在对干扰素治疗的反应上，宿主因素可能起更重要的作用。本研究分别应用SSCP 和克隆测序法对HVR1准种异质性进行了检测，结果发现，HVR1准种的复杂性与基因的差异性均与IFN 应答有关，无应答组IFN 治疗

24、前HVR1准种的复杂性与基因的差异性明显高于应答组；且HVR1准种的复杂性程度与HCV RNA 含量无关，提示HVR1准种异质性程度是预测IFN 疗效的一个独立因素。治疗前准种异质性程度高的患者对IFN 的应答率低，表明这些患者体内可能存在耐IFN 的病毒株，其确切机制尚不清楚，可能与机体的免疫压力选择作用有关。HVR1区为机体的免疫应答部位，IFN 治疗在提高机体抗病毒的免疫效应的同时也使对HVR1的免疫压力增加，促使更多的变异发生，当IFN 敏感株的复制被抑（下转第722页）617中国免疫学杂志2005年第21卷无效的。但是同一实验数据的比较可用于检测相关产品的体液免疫反应。6. 4 二次

25、筛选 二次筛选的主要目的是分析初选的阳性抗体中具有中和活性作用的抗体，它包括体外细胞生物学试验。在试验前有必要作对照，把血清中的其他干扰因子和抗治疗蛋白的抗体区分开来。检测中和性抗体的生物学实验受多种因素的影响，不同实验室检测中和性抗体数据不能进行比较，同一实验室同一试验设计，严格的实验操作或者不同实验室进行合作研究用同一试剂及参照标准品所做的实验数据可进行有效的比较。治疗性蛋白对治疗各种疾病起着重要作用，任何治疗性蛋白在机体内都会产生免疫反应，这是临床用药的一大障碍。用各种方法降低治疗性蛋白质的免疫原性，提高蛋白质的特性对临床用药有利，特别是一些新技术的出现为根本降低治疗性蛋白的免疫原性带来

26、了希望。7 参考文献1 Vandefrschueren S M ，Stassen J M ，Collen D. On the immunogenicity ofrecombinant staphylokinase in patients and in animal models J . Thromb Haemost ，1994；72（2）：297-301.2 Scharrer I. Recombinant factor a for patients with inhibitors to factoror IX or factor deficiency J . Haemophilia ，1999

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35、个月时，HCV RNA 仍未阴转或ALT 仍未降至正常，则该患者对IFN 无应答的可能性较大。6个月时仍为此种情况则为无效，应停药。在对该组病人的动态观察中发现，3个月时应答率为22. 2%，6个月时为38. 9%。部分患者虽然治疗结束时HCV RNA 未阴转，但SSCP 条带数较治疗前减少。由于该组患者均未延长治疗时间，未能观察到延长疗程是否可以提高IFN 应答率。因此建议今后对治疗结束时无应答者，但SSCP 条带数在治疗过程中逐渐减少者，可适当延长疗程。4 参考文献1 Kurosaki M ，Enomoto N ，Marumo F et al. Evolution and selectio

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