抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定

1、抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定           作者：王婉，高媛，杨金菊，柳晓兰，鞠艳芳，刘莉，陈志成 刘蓉，                    迟俊，邢维贤，高建恩，安立国，孙启鸿【摘要】  本研究制备抗人尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UDP?glucose pyro

2、phosphorylase 2）的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定。将正常成人肝组织匀浆离心并分离肝脏胞浆总蛋白，用肝脏胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，通过间接ELISA法、Western blot及免疫组织化学的方法对单克隆抗体进行特性鉴定，通过Uni?ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗体特异性。结果表明：通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人UGP2 mAb 的杂交瘤细胞系BAD062，其分泌的单克隆抗体的Ig亚类(型)为IgG2b ()，Western blot 结果显示该抗体可以特异地识别分子量为56 kD的蛋白；应用单克隆抗体BAD062

3、对人肝脏cDNA表达文库（Uni?ZAP XR）进行筛选，阳性噬菌斑测序结果显示2个阳性克隆插入序列均为UGP2。结论：单克隆抗体BAD062特异地识别抗原UGP2，该抗体可用于ELISA检测、Western blot、免疫组织化学实验，为UGP2的研究提供了有力的工具。 【关键词】  尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2 单克隆抗体 cDNA表达文库Preparation and Identification of Monoclonal Antibody Against       Abstract  

4、0; The study was aimed to generate monoclonal antibodies (mAbs) against homo sapiens UDP?glucose pyrophosphorylase 2 (UGP2).  Normal human liver tissues  homogenized, and cytosolic proteins  isolated by centrifugation were used to immunize BALB/c mice to generate mAbs by hybridoma tec

5、hnique. The mAbs were identified by ELISA, Western blot, and immunohistochemistry  assay. The antibody specificity was confirmed by Uni?ZAP expression library screening. The results indicated that  one hybridoma BAD062 secreting specific mAb against UGP2 was established. The Ig subclass of

6、 this mAb was IgG2b (), and it could be used in ELISA, Western blot, immunohistochemistry assay. The antigen recognized by BAD062 mAb was localized in the hepatocyte cytoplasm, with molecular weight of 56 kD in the cytosolic proteins of human liver tissue. The BAD062 mAb was further confirmed by imm

7、unoscreening of Uni?ZAP XR liver cDNA expression library. It is concluded that a   hybridoma cell line stably secretes specific mAb against UGP2. This mAb reacted with UGP2 in ELISA, Western blot, immunohistochemistry assay, and would be very useful for the UGP2 studies.   

8、Key words    UGP2; mAb; cDNA expression library    尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UDP?glucose pyrophosphorylase2, UGP2）是糖原生物合成过程中的一种酶，由508个氨基酸组成，相对分子质量（Mr）约为56 000，催化UTP与葡萄糖?1?P的反应, 生成UDP?财咸烟恰?UDP?财咸烟鞘侵饕?活化糖的形式，作为葡萄糖基供体参与蔗糖、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白的合成代谢1。摄入人体内的葡萄糖可在葡萄糖激酶、葡糖磷酸变位酶和尿苷二磷酸葡糖焦磷酸

9、化酶（UGP2）的催化下形成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）。此外，UGP2还与腺嘌呤二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）相偶联，形成ADPG，参与淀粉的合成1,2。在糖原合成和分解过程中该酶的缺陷即导致临床表现的糖原累积病。UGP2在骨骼肌中高表达，其次在肝脏中也有较高的表达量。我们应用成人肝组织胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，其中1株为鼠抗人UGP2单克隆抗体，并对其特异性进行了鉴定。这为进一步研究UGP2在糖蛋白代谢中的作用奠定了基础。    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(3) 抗尿苷二磷酸葡萄糖焦

10、磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定材料和方法    材料    免疫和筛选用成人肝组织胞浆总蛋白，由本室制备。其它主要试剂和仪器包括：弗氏佐剂（Sigma公司产品），羊抗鼠IgG?HRP（中山公司产品），蛋白酶抑制剂（Roche公司产品），BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司产品），PVDF膜（Amersham公司产品），ECL反应试剂盒（Amersham公司产品），DY89?并蛐偷缍?玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司产品）。    成人肝组织胞浆总蛋白抗原的制备   

11、; 取10 g正常人肝组织加40 ml匀浆缓冲液3，以每分钟700-750转速率制成肝组织匀浆，然后10 000×g离心10分钟，取上清，即获得成人肝组织胞浆总蛋白；采用BCA法测定蛋白浓度，SDS?PAGE鉴定抗原的相对分子质量。    鼠抗人mAb的制备    将成人肝胞浆总蛋白1 mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化，给BALB/c小鼠多点皮下注射。首次免疫后4周，再加强免疫1次，1周后经尾静脉取血，分离血清，用ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，取小鼠脾细胞与X?653细胞进行细胞融合，采用杂交瘤技术

12、制备mAb。    mAbs的鉴定    Western blot 分析  线粒体总蛋白经SDSPAGE后，电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1小时，然后加入12 000稀释的mAb，室温下孵育2小时（或4过夜），TBST缓冲液洗膜后，加入羊抗鼠IgG?HRP抗体（15 000稀释），室温下孵育1小时，TBST缓冲液洗膜后，ECL法显色。    免疫组织化学鉴定  用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片，PBST浸洗5分钟后每个组织片滴加25 mg/L的亲和素（avidin)

13、 50 l，室温孵育15分钟，滴加3% H2O2?布状迹?室温孵育15分钟。滴加正常羊血清室温下封闭30分钟，加入1100稀释的鼠抗人PDC?E2 mAb，4孵育过夜。以PBS洗片后加入羊抗鼠IgG?HRP，37孵育30分钟，用PBS洗片后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后封片。百事通     抗体识别抗原的鉴定    Uni?ZAP XR人肝脏cDNA表达文库筛选：取大肠杆菌XL1?BLUE MRF'过夜培养菌接种于LB培养液中，37震荡培养至OD600为0.7左右，  11.5×g条件下离心10分钟，用

14、10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至OD600为0.5，取适当稀释的文库60 l（含约50 000个噬菌体）与600 l重悬的XL1?BLUE MRF混匀后37温育20分钟，铺至150 mm的NZY?LB平板上，42倒置培养至噬菌斑模糊可见，将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面，37继续培养3.5小时，用防水墨水定位后，剥离滤膜，进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆，用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、测序。    结    果    成人肝组织胞浆总蛋白的分析  

15、;  成人肝组织胞浆总蛋白的SDS?PAGE银染分析结果显示，肝脏胞浆总蛋白的相对分子质量集中在70-35 kD范围内，较大分子量和较小分子量的蛋白含量相对较低（图1）。    鼠抗人mAbs的制备及初步鉴定    应用细胞融合、筛选和克隆化，获得1株抗人成人肝胞浆总蛋白阳性的细胞株BAD062，其亚类（型）为IgG2b ()。    抗体的特异性鉴定    正常成人肝组织胞浆总蛋白作为抗原进行Western blot鉴定。泳道1以正常鼠血清为一抗，作为实验的阴性对

16、照，泳道2以分泌抗人UGP2抗体的杂交瘤细胞株BAD062的细胞培养上清作为一抗。结果显示，BAD062能特异识别成人肝胞浆总蛋白中分子量约为56 kD的蛋白（图2箭头所示）。    mAb的免疫组织化学鉴定    取冰冻的正常成人肝组织切片进行免疫组织化学检  测。结果显示，鼠抗人UGP2 mAb识别的抗原定位于成人肝组织肝细胞胞浆内（图3）。    抗体识别抗原的鉴定    用BAD062的杂交瘤细胞培养上清对Uni?ZAP XR人肝脏cDNA表达文库进行第一轮

17、筛选，铺板密度为5 0000个噬菌体/150 mm平板，以保证在1张NC膜上尽可能多的增加免疫筛选的噬菌斑数，经过第1轮筛选，共得到了3个强阳性噬菌斑（图4A），挖取此3个阳性噬菌斑混合后进行第2轮筛选，铺板密度为1 000个噬菌体/150 mm平板，以获得可以分离的独立克隆。经过第2轮筛选后，阳性噬菌体得到大大的富集，第2轮筛选得到的阳性噬菌斑约40个，大约富集了500倍（图4B）。分离其中的5个独立阳性克隆进行体内剪切并转入大肠杆菌中，并进行了诱导表达，测序。测序结果经BLAST序列比对后显示插入基因读码框的第一个氨基酸均是UGP翻译区的第120位苯丙氨酸（Phe）（图5）。为了进一步证明

18、筛选的可靠性，又对分离得到的阳性克隆进行了Western blot鉴定，结果显示抗体    BAD062与诱导后的细菌总蛋白有特异的反应条带，分子量约为53 kD，与预测的融合蛋白分子量一致（图6）。因此，可以证明BAD062所识别的蛋白为UGP2。    讨    论    糖原累积病是一类由于先天性酶缺陷所造成的糖原代谢障碍疾病。这类疾病共同的生化特征即是糖原贮存异常。糖原主要贮存在肝和肌肉中作为备用能量，摄入体内的葡萄糖在葡萄糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦

19、磷酸化酶的催化下形成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）。糖原合成和分解过程中酶的缺陷即导致临床表现的糖原累积病。哺乳动物细胞UGP2缺失引起细胞膜糖蛋白合成降低， 影响细胞正常分化和完整性3,说明其对生物正常代谢是不可或缺的。    我们采用正常成人肝组织匀浆离心并分离肝脏胞浆总蛋白，用肝脏胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备得到了1株抗UGP2的杂交瘤细胞株BAD062。Western blot表明，该抗体可以特异地识别成人肝胞浆总蛋白中分子量为56 kD的蛋白，并通过Uni?ZAP XR人肝脏cDNA表达文库筛选鉴定BAD062识别的抗原为UGP2。免

20、疫组织化学结果显示，BAD062识别的抗原定位于成人肝组织肝细胞胞浆中。筛选出的杂交瘤细胞分泌的mAb抗体稳定性良好，为将来筛选表达UGP2的细胞和（或）组织、UGP2的组织及细胞定位、寻找与UGP2相互作用的分子提供了有力的工具。【参考文献】  1Eimert K, Villand P, Kilian A, et al. Cloning and characterization of several cDNAs for UDP?glucose pyrophosphorylase from barley (Hordeurn vulgare) tissues. Gene, 1996;

21、170: 227-2322Ap?Rees T, Leja M, MacDonald FD, et al. Nucleotide sugars and starch synthesis in spadix of arum maculatum and suspension cultures of glycine max. Phytochem, 1984; 23: 2463-24683Gao J, Gao Y, Ju Y, et al. Proteomics?based generation and characterization of monoclonal antibodies against human liver mitochondrial proteins. Proteomics, 2006; 6: 427-4374Lai K,