基于磁性纳米粒子抗体复合物分离CD34+细胞的新技术

1、基于磁性纳米粒子抗体复合物分离CD34+细胞的新技术         您正在浏览的临床医学论文是基于磁性纳米粒子抗体复合物分离CD34+细胞的新技术                    【摘要】         本研究合成磁性纳米粒子抗体

2、复合物(magnetic nanoparticlesantibody，MNPsAb),建立用此复合物从脐带血中分离CD34+细胞的方法并评价其效果。利用磁性纳米粒子抗体复合物的超顺磁性和对CD34+细胞的识别及结合功能，在外加磁场的作用下，分离脐血中的CD34+细胞;用扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)观察分离后CD34+细胞的形态变化;用流式细胞仪(flow cytometer ，FCM)分析分离效率;用液体培养和集落培养鉴定CD34+细胞增殖能力和多向分化能力。结果显示：利用磁性纳米粒子抗体复合物可以快速、高效地将CD34+细胞从脐血中分选出

3、来，而且分离后的CD34+细胞仍然保持正常形态、高度的增殖能力和多向分化能力。结论：成功地研制了磁性纳米粒子抗体复合物分离CD34+细胞技术，该技术能高效、快速地分离CD34+细胞。        【关键词】 磁性纳米粒子 脐血 CD34细胞        A New Method for Isolating CD34+ Cells Based on Complex of Magnetic Nanoparticles and Antib

4、ody        Abstract The purpose of this study was to synthesize the complex of magnetic nanoparticles and antibody, and to apply them to isolate the CD34+ cells from umbilical cord blood, then to evaluate its separation efficiency. The complex of magnetic nano

5、particles and antibody was used to separate CD34+cells from umbilical cord blood in the outer magnetic field because of its superparamagnetism, specific identification and function of combination with CD34+ cells. Scanning electron microscopy was used to observe the morphology of the separated CD34+

6、 cells. Flow Cytometer was applied to evaluate the sorting efficiency of magnetic nanoparticles,liquid culture and colony culture were taken to assay proliferation and differentiation capacity of the separated CD34+ cells. The results showed that the CD34+ cells from umbilical cord blood were isolat

7、ed fast and effectively by the complex of magnetic nanoparticles and monoclonal antibody. Moreover, the isolated CD34+ cells still maintained its normal morphology, highly proliferative and differentiative capacity. It is concluded that the complex of magnetic nanoparticles and monoclonal antibody h

8、as been successfully synthesized and developed as a technique which efficiently and quickly isolates CD34+ cells from umbilical cord blood.        Key words magnetic nanoparticle; umbilical cord blood;CD34 cell        造血

9、干细胞是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞。现已知道，造血干细胞不是单一的细胞群体，这些细胞不仅含量极低，而且没有特定的、稳定的表型1，因此分离造血干细胞非常困难。最初分离富集细胞的方法是依据细胞的浮力密度等物理学特性，采用速度离心沉淀、密度梯度离心以及逆流离心淘洗等技术分离，分离过程操作繁琐、费时，分离的纯度不高。1975年Milstein和Kohler发明单克隆抗体技术2，给细胞分离带来了新的技术;流式细胞分选术的发展使细胞分离技术出现了质的飞跃，极大地提高了细胞分离纯化的效率，使得高效快速分离纯化一些含量很少的细胞成为可能。    &

10、#160;   造血干细胞有多种细胞表面标志，但是鉴别造血干细胞最常用的是CD34抗原3。对于分离CD34+细胞，目前常用的有流式细胞术，免疫磁性细胞分离两种方法。流式细胞仪虽然可对单个细胞逐个的进行高速、准确的定量分析和分类，但缺点是速度较慢，一般每小时处理2.0×107 细胞4，而且由于不能保证分离过程完全无菌， 分离得到的细胞很难再进行体外培养，因此应用受到一定限制。        近年来国际上出现的免疫磁性细胞分离技术，大大简化了分离的程序、提高了分离效率，并且分离所

11、需设备简单，可以在每个实验室进行。目前，免疫磁珠细胞分离产品主要由德国和美国一些知名生物技术公司生产，价格昂贵，而且产品所需磁珠粒径大部分在微米级，由于磁珠粒径较大，在分离过程会对细胞造成机械损伤，分离后磁珠的存在还会在体外培养等后继实验产生影响。        中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)基于磁性纳米粒子抗体复合物分离CD34+细胞的新技术针对这一问题，我们设计了基于磁性纳米粒子和抗体复合物应用于细胞的分离新技术。磁性纳米粒子对细胞的影响较小，并且在分离的灵敏度、速度和精

12、确度上有优势5。我们采用磁性纳米粒子直接与CD34单克隆抗体连接，构成磁性纳米粒子-抗体复合物，将该复合物加入到需要分离的样品中，磁性纳米粒子便可以与目的细胞进行特异性结合。再用外磁场对连有磁性纳米粒子的目的细胞进行阻留，从而实现分离。我们利用磁性纳米粒子的巨大比表面积和超顺磁性可进一步提高分离效率和专一性，而且磁性纳米粒子的尺寸优点，可将对细胞生长和分化影响降低到最小。CD34+细胞与磁性纳米粒子在孵育过夜后可以自行脱离，故不需加洗脱液，可直接培养。        材料和方法   &

13、#160;    磁性纳米粒子的合成        用FeSO4·7H2O和 FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液共沉淀法形成Fe2O3纳米粒子，然后采用反向微乳液法使正硅酸乙酯水解的同时将二氧化硅包裹在Fe2O3外面，以形成核壳型的磁性纳米粒子，并通过TEM和穆斯堡尔谱仪表征。        磁性纳米粒子表面的氨基修饰    &

14、#160;   将氨基修饰到磁性纳米粒子上的具体方法如文献6,取一定量SiO2包裹的磁性纳米粒子，加入到甲醇和丙三醇的混合体系中超声30分钟，再加入一定量的AEAPSN(2氨乙基)3氨基丙基三甲氧基硅烷超声均匀，在60下搅拌反应5个小时，甲醇洗涤，真空干燥备用。        抗CD34单克隆抗体的磁性纳米粒子连接        将一定量上述连接氨基的磁性纳米粒子分散在磷酸缓冲液(phosphate buf

15、fered saline,PBS,0.1 mol/L, pH 7.4)中,加入一定量的戊二醛,反应4-5个小时后,将多余的戊二醛洗去,重新分散在PBS中,然后加入一定量的抗CD34单克隆抗体,反应1.5-2.5小时，再将多余的抗体用PBS洗净，同时收集残液(抗体与磁性纳米粒子反应后残余的液体        )、两次的漂洗液(分别称为一洗、二洗)。        抗体连接效率检测     

16、   取上述各组液体加入96孔酶标板中，每组设3个平行孔。Tecan酶标仪测波长280 nm紫外吸收值，判断抗体连接效果。        单个核细胞(MNC)的获取        新鲜脐血由上海国际和平妇幼保健院提供，20 U/ml肝素抗凝，采集量20-50 ml，样品在采集6小时内分选。将脐血缓慢加注于Ficoll (1.077 g/ml，)的界面上(不能破坏液面)，体积比约11。置低速离心机中400&#

17、215;g离心30分钟;收集界面层MNC,用RPMI 1640培养液洗涤2次。        CD34+细胞的分离纯化        将分离的MNC与连有抗体的粒子按体积比11轻轻混匀，室温下反应30分钟，然后磁性分离5分钟，去上清;用RPMI 1640培养液洗3次。        分离的CD34+细胞形态的SEM观察   &#

18、160;    我们采取固定脱水干燥法，即将分离纯化的CD34+细胞立刻用2%戊二醛(0.1 mol/L磷酸缓冲液配制pH 7.4)固定2小时，用缓冲液漂洗。1%锇酸固定1小时。用缓冲液漂洗，经70%、85%、95%、100%、100%逐级乙醇脱水(每级15-20分钟)，过渡到醋酸异戊酯，经干燥，真空镀金后SEM观察。        分离效率的流式细胞仪检测        用FITC标记的羊抗鼠I

19、gG1加入到带有磁性纳米粒子的CD34+细胞中，室温下反应20分钟，然后置低速离心机离心(400×g，5分钟)，去上清，用PBS洗涤2次，最后重新分散在PBS中, 用FACSCalibur 流式细胞仪检测。        CD34+细胞的液体培养        2 ml RPMI 1640体系中含20%胎牛血清(FBS，Gibco公司产品)，干细胞因子(SCF)40 ng/ml，粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)30 ng/

20、ml,白介素1(IL1)、白介素3(IL3)、白介素6(IL6)、血小板生成素(TPO)各20 ng/ml，红细胞生成素(EPO)5 U/ml，5%牛血清白蛋白(BSA)。细胞浓度为2×105/ml，将上述体系接种于培养瓶中，置37 ，5% CO2饱和湿度下培养一周，在倒置显微镜下观察。        结 果        磁性纳米粒子的合成表征       

21、; 图1是经二氧化硅包裹后的磁性纳米粒子的TEM照片。从图可以很清楚的看到，合成的核壳型磁性纳米粒子不仅外貌光滑粒径均匀，而且分散性较好。图2是二氧化硅包裹前后磁性纳米粒子的穆斯堡尔谱。包裹后样品的穆斯堡尔谱与包裹前相比，其主要的差别是原来的显著不对称向内加宽的磁分裂六线峰出现了一个双峰。双峰的出现是由于包裹的SiO2与Fe2O3发生了强烈的相互作用而产生的顺磁相所致。这一结果表明，SiO2不仅成功地包裹在Fe2O3表面上，而且两者之间有较强的相互作用7，8。        抗体连接率检测 &#

22、160;      图3为酶标仪测得的各组分的吸光值。由表中数据可知，连接抗体的磁性纳米粒子明显比未连接前的吸光值增大，表明CD34单克隆抗体已经通过化学键合的方法成功地连接到MNP表面。这为我们下一步实验提供了可靠依据。而且根据文献9公式测得抗体的连接效率为3.77×10-4 mg/c您正在浏览的临床医学论文是基于磁性纳米粒子抗体复合物分离CD34+细胞的新技术            m2。 &

23、#160;      C(mg/ml)=OD(280 nm)×1.4        分离出的CD34+细胞形态        图4是带有磁性纳米粒子的CD34+细胞SEM照片。借助SEM可以看到，分离后的CD34+细胞仍保持正常形态，而且细胞表面连接有磁性纳米粒子。从图中还可以看出磁性纳米粒子相对于细胞粒径很小，在复杂的生物体系中磁性纳米粒子虽有一定团聚现象存在，但不

24、影响细胞的分离效果，对细胞的形态也没有太大的影响。因此，采用磁性纳米粒子分离CD34+细胞，对细胞的形态几乎没有影响。        分离的效率        图5是磁性纳米粒子抗体复合物分离纯化脐血CD34+细胞前后的流式细胞仪检测结果图。由图可知，分离前CD34+细胞在单核细胞中含量很低，一次分离后的CD34+细胞的纯度可达80.91%,这说明磁性纳米粒子可以有效使脐血中的CD34+细胞得到富集。通过计算，回收率可达59.6%,与同

25、类文献10报道结果相比较，磁性纳米粒子的分离效果较好。可见，用磁性纳米粒子抗体复合物分离可得到较高纯度、高回收率的CD34+细胞。        Figure 5. Flow cytometry analysis of CD34+ cells before and after separation by MNPsAb. M1：CD34- cells; M2：CD34+ cells. A: before separation. B:after separation.    &#

26、160;   CD34+细胞的扩增        图6是经过液体培养的CD34+细胞。经过5天，在培养液中有核细胞总数可扩增20多倍，与文献11报道相符。这表明经过磁性纳米粒子分离的CD34+细胞保持高度增殖能力和自我更新能力。Figure 6. Microscopic photograph of CD34+ cells cultured for 7 days in liquid media. (magnification ×250).   &#

27、160;    CD34+细胞的集落培养        图7所示的是经过14天半固体培养的CD34+细胞。可以观察到CD34+细胞已经分别在不同细胞因子的作用下形成红细胞集落和粒巨噬系祖细胞集落，表明分离后的CD34+细胞仍具有多向分化能力。        Figure 7. Microscopic photographs of CD34+ cells cultured for 14 days i

28、n semisolid media. A:CFUGM. B: BFUE (magnification ×250).讨 论        造血干祖细胞主要存在于骨髓、脐血和外周血中，其中骨髓中含量最高。虽然脐血中造血干祖细胞的含量比骨髓低,但脐血中的造血干祖细胞较外周血和骨髓更为原始，具有来源广泛、采集方便、移植成活率高、移植物抗宿主反应轻、高增殖和长期骨髓重建等特点，有望成为骨髓造血干祖细胞的良好替代品12。鉴于单份脐血中干细胞数量少，无法满足成人移植的需求。因此，须将CD34+细胞进行扩增，以获得足够数

29、量的造血干细胞。        我们采用磁性纳米粒子抗体复合物即可解决这一问题。在磁性纳米粒子连上CD34单克隆抗体,合成了磁性纳米粒子抗体复合物(在4中能保存较长时间，但是我们为了保证分离效果，一般情况下都是现用现合成)，此复合物可直接快速的从脐带血中分离出高纯度的CD34+细胞。我们用SEM观察分离出的CD34+细胞,细胞形态保持正常状态,说明磁性纳米粒子对CD34+细胞的形态影响很小;用流式细胞仪检测，磁性纳米粒子分离的CD34+细胞具有较高的纯度和较低的丢失率;对CD34+细胞分别进行液体培养和集落培养,发

30、现CD34+细胞仍保持高度增殖能力和多向分化能力。以上事实都说明我们利用磁性纳米粒子抗体复合物来分离CD34+细胞是可行的，这为开展CD34+细胞分离纯化的临床应用奠定了实验基础。此外，由于磁性纳米粒子粒径非常小，可以直接将带有磁性纳米粒子的CD34+细胞进行流式细胞仪检测。        因此，我们认为利用磁性纳米粒子分离脐带血中CD34+细胞具有很高的研究与应用价值，对细胞移植、细胞治疗、成分输血和基因治疗领域具有十分重要的意义。       

31、; 【参考文献】        1Thomas TE, Miller CL, Eaves CJ. Purification of hematopoietic stem cells for further biological study. Methods, 1999; 17：202-218        2唐佩弦.造血干细胞研究发展历史引发的思考.中国实验血液学杂志, 2005;13：723-732  &#

32、160;     3Halens S，Kohn DB.Gene therapy using hematopoietic stem cells：sisyphus approaches the cerst. Hum Gene Ther, 2000;11：1259-1267        4徐勇，霍梅.免疫磁珠分离及流式细胞仪分选纯化外周血CD34+/CD90+干细胞.临床检验杂志, 2004;22: 246-248        5Kuhara M, Takeyama H, Tanaka T, et al. Magnetic cell separation using antibody binding with protein a expressed on bacterial magnetic particles. Anal Chem, 2004; 76: 6207-6213   &