六种非Alzheimer神经变性疾病对βA4表达的研究

1、    六种非Alzheimer神经变性疾病 对A4表达的研究        【摘要】目的观察6种非Alzheimer神经变性疾病对A4在脑组织中的表达，探讨A4表达与神经元变性和缺失的关系。方法用免疫组化的ABC法对6种非Alzheimer神经变性疾病进行A4免疫组化染色，观察其病理形态、阳性程度、脑内分布。在免疫组化染色的同时做刚果红染色。 结果这6种疾病中有4种在脑皮质第3、5层中A4有表达。而刚果红染色除进行性核上性麻痹轻度阳性外，其余均为阴性。结论A4在脑

2、组织中的表达并非Alzheimer病所特有，而是多种神经变性疾病的共同特征；A4免疫组化法的阳性结果不同于传统的刚果红染色法。A4与神经元变性和缺失可能有关联。【关键词】淀粉样-蛋白神经变性疾病 A study of A4 expression in six non-Alzheimer neuro degenerative diseasesLU Bingxun*, M. Iulian, NING Qun, et al. * Department of Neurology, Nanfang Hospital, First Military Medical University,Guangzhou

3、 510515【Abstract】ObjectiveTo observe the A4 expression in six kinds of non-Alzheimer neurodegenerative diseases and to investigate the effect of A4 expression on neuronal degeneration and loss. MethodWith the immunohistochemical ABC method and Congo red staining, we observed the A4 plaques' path

4、ologic characteristics and the levels of A4 expression and distribution in the brain tissue. ResultsWe found A4 expression in the cortical layers 3 and 5 in 4 non-Alzheimer neurodegenerative diseases,while using Congo red staining, only PSP showed slightly positive results. ConclusionThe diposits of

5、 A4 in brains are common characteristics in quite a number of neurodegerative diseases, so it was not just specific to Alzheimer's disease.The result of immunohistochemical staining was different from that of conventional Congo red Staining. It suggested that A4 might be related to neuronal dege

6、neration and loss.【Key words】Amyloid beta-proteinNeurodegerative disease老年斑、神经原纤维缠结和血管壁淀粉样变是Alzheimer病（AD）大脑的病理特征性改变，而-淀粉样蛋白（A）是老年斑和血管壁淀粉样变的主要成分。现认为A沉积引起细胞变性和缺失是AD发病的中心环节1。但近年发现在其他神经变性疾病,如Huntington病增加。本研究对6种神经变性疾病用免疫组化法的ABC法检测A4在脑内的表达，旨在探讨A4在非Alzheimer病神经变性疾病中，脑内表达水平和分布及与发病的关系。资料和方法研究对象：24例均为麻省总医院临

7、床病例及病理标本，其中男20例，女4例，平均年龄为67.2岁，24例均经尸检病理诊断证实。 弥漫性Lewy体病（DLBD）5例,皮克病（Pick）4例，进行性核上性麻痹（PSP）5例,帕金森病（PD）4例,多系统萎缩（MSA）3例,肌萎缩侧索硬化（ALS）3例。实验方法： 免疫组织化学染色(IHC)，将上述病例颞叶(21区)和额叶(11区)脑组织标本常规行石蜡包埋,切片,片厚4 m，采用ABC法进行免疫组化染色。依次加入第一抗体（鼠抗人A4单克隆抗体）、第二抗体、卵白素-生物素过氧化酶（AB）复合物、二氨基联苯胺（DAB）显色。实验主要步骤：在37水浴条件下，一抗、二抗、AB复合物分别孵育切片

8、120、60、30分钟,每一步骤间均以0.01 mol/L(pH7.4)磷酸缓冲液冲洗，DAB显色510分钟，并镜下控制。进行IHC染色时，每例同时设立阳性对照，阴性对照。表1四种变性疾病脑组织中A4表达水平与分布组织种类PICKPDPSPDLBD皮质第3层+皮质第5层+-+白质-+-血管-+-+-+-+血管周围-+-+-+-毛细血管+-+-+-+-+-+-毛细血管周围-+-+-+-+神经元内+-+-+-+-+-注：ALS和MSA均为阴性在免疫组化染色同时，对以上标本同部位切片作刚果红染色，刚果红染色设阳性对照。结果A4表达水平判定：在100倍镜下随机选5个视野行A4阳性斑块记数，求其平均值。

9、依A4免疫组化染色阳性斑块数分四个等级：“-”表示阴性，“+”表示弱阳性，每视野平均斑块数为130；“+”表示阳性，每视野平均斑块数为3060；“+”表示强阳性，每视野平均斑块数为100以上。1.A4在脑组织的表达水平与分布:在研究的6种变性疾病中，Pick、PD、PSP、DLBD A4有阳性表达，而ALS和MSA A4为阴性表达。A4的表达水平和分布： 血管：A4阳性的血管主要分布在皮质第3、5层，斑块有些显棕黑色，覆盖了血管；有些呈淡棕色。100% PD，75% Pick病，40% PSP、DLBD病人中血管上A4表达为阳性。 血管周围：斑块呈淡棕色，沙样型。50% PD和20% PSP显

10、示上述特征，而Pick、DLBD血管周围A4表达均为阴性。毛细血管：有A4阳性斑块的毛细血管主要分布在皮质第3、5层，有些呈棕黑色、有些呈淡棕色；100% PD、 40% PSP、20% DLBD病人毛细血管出现A4阳性。 毛细血管周围: A4阳性斑呈淡棕色,沙样分布。100% PD，40% PSP，20% DLBD A4表达呈阳性。神经元内：为沙样分布的淡棕色斑，50% PD，75% Pick病、60% PSP，20% DLBD表达阳性（表1）。刚果红染色：只有PSP病例刚果红染色轻度阳性，其他病例均为阴性。从表1可看出A4主要在皮质第3、5层，血管、毛细血管、毛细血管周围、神经元内表达，而

11、白质未见A4的沉积。其分布同Alzheimer病。2. A4的病理类型(表2)：依A4阳性斑的形态将其分3型，型：典型大核心型。斑块为深棕色，中间有一大的深棕色核，核心象是一个死亡的神经元。主要分布在皮质第3层。 型：典型小核型。斑块为棕黑色，有一小圆形的棕黑色核心，貌似中心有一血管。主要分布在皮质第5层。型：非典型沙样型。斑块为淡棕色，沙样分布，此型斑块好象为棕色物质从死亡的神经元、血管内漏出,主要分布在皮质第3、5层，尤其在神经元中 。Pick病主要为典型大核心型和非典型沙样型，PD、PSP、DLBD可见各种类型，PD、PSP以典型大核心型为主，而DLBD则以典型小核心型为主。表2四种变性

12、疾病脑组织中A4的病理分型疾病名称典型大核心型典型小核心型非典型沙样型PICK+-+PD+PSP+DLBD+讨论神经系统变性疾病是一组原因未明的神经系统退行性变性疾病，大多数疾病伴有痴呆。在致痴呆疾病中，Alzheimer病是研究得最多的一种。研究表明,A4 是由42个氨基酸组成的蛋白质，由其前体（amyloid precursor protein，APP）经过两种酶（-secretase和-secretase）的裂解作用后形成2，编码其前体的基因位于21号染色体上3，它转录的mRNA在脑外组织中也存在，但仅在大脑中的APP才能衍生成A4，因此，A4被认为是Alzheimer病的标志。近年观察

13、到A4淀粉样变也可在Huntington病中增加。有学者发现头部外伤的几天后就启动了含A4斑块形成4，还有人在正常老年人脑中也发现不同程度的A4表达5,6，因而，对A4的表达是Alzheimer病的标志提出了疑问。我们对6种神经变性疾病进行A4研究，发现Pick、PD、PSP、DLBD脑中也存在与Alzheimer病类似的病理变化，而ALS、MSA则无此现象。Pick病是以进行性智能障碍为主要表现的神经变性疾病，其病理特征为额叶、颞叶萎缩，有Pick体和Pick细胞，亦可见到老年斑和神经原纤维缠结。临床症状难以同Alzheimer病鉴别，病理上鉴别主要靠发现Pick体和Pick细胞，但在没有发

14、现上述特征时，即使从病理上也是难以鉴别的。 帕金森病是常见的锥体外系神经退行性变性疾病， 40%伴有痴呆。以往认为帕金森病的痴呆为皮层下痴呆,但近年研究发现皮层同样有萎缩，存在有皮层痴呆。进行性核上性麻痹是一种少见的神经变性疾病，病程中常伴有痴呆。病理改变在基底节、脑干和小脑。可见神经元缺失、神经原纤维缠结和胶质细胞增生。也有人在大脑皮层发现有大量的嗜银斑块的存在，同Alzheimer病一样，于是人们把这种病变叫着PSP伴有Alzheimer病。 弥散性Lewy体病也是一种以痴呆为主要表现的神经变性疾病，临床上难以与Alzheimer病区别，病理特征为弥漫性脑萎缩，可见弥漫的Lewy体。从以上

15、可看出，上述4种疾病在临床症状上乃至部分病理改变上与Alzheimer病有相似之处，而我们的研究也发现A4在上述疾病中亦有表达，且其表达水平及分布区类似于Alzheimer病。多系统萎缩是一种有家族遗传性的进展性神经变性疾病，病理改变为神经元缺失和胶质细胞增生，无其他特异性病理改变，部分病例可伴有痴呆。肌萎缩侧索硬化症是一种侵犯上、下两级运动神经元的慢性变性疾病。可伴有痴呆。病理改变为脊髓前角细胞及脑干运动神经元退变，大脑皮质中央前回及额叶萎缩，以第3、5层锥体细胞退变严重。但在我们A4的研究中两种疾病脑内表达均为阴性。在刚果红染色中，只有PSP呈轻度阳性，其余病例均为阴性 ，可见免疫组化染色

16、法A4阳性率明显高于刚果红染色法。免疫组化染色不仅观察到典型的斑块，还可观察到非典型的沙样沉积，而后者刚果红染色是无法观察到的。关于A4在人脑内增加与脑神经元变性的机制：此项研究目前主要在Alzheimer病上进行，其他变性疾病研究甚少。现认为A4是引起神经元变性、死亡的中心环节。有人利用动物转基因技术将A4基因转入动物神经元，发现它可诱发细胞凋亡，并使动物平均寿命缩短50%7；体外细胞培养发现A4能使神经元发生变性、死亡8，上述实验充分证实了A4在神经元变性、死亡中起主要作用。Donnelly等发现白细胞介素-1在体外可激活APP基因的启动区，使APP过分表达。现认为基因的突变改变了APP程

17、序，导致APP的代谢异常，而头部外伤或缺血则诱导白细胞介素-1的表达，而IL-1可激活APP基因的启动区，导致APP的过分表达，结果使得A4表达增加，致使神经元变性、坏死。我们的研究发现，在其他一些神经变性疾病中同样有A4的表达，因此，可认为上述机制同样适用于这些神经变性疾病。事实上，上述神经变性疾病均伴有痴呆，这种症状的相同性提示在病理改变上也有某种共同性，即A4的增多与神经元变性、缺失有关。在以往的研究中，都是用刚果红染淀粉样蛋白，我们的研究表明，该方法的阳性率明显低于免疫组化染色，这种方法学上的缺陷是以往在非Alzheimer病神经变性疾病中，较少发现淀粉样蛋白表达的原因。本研究发现：（

18、1）A4在脑血管和老年斑中的沉积是多种神经变性疾病中常见的一种病理改变，并非Alzheimer病所特有；（2）在神经变性疾病中，A4的表达增高是神经元的变性、缺失的主要原因；（3）免疫组化染色法A4阳性率明显高于刚果红染色法。作者单位：陆兵勋、宁群510515 广州，第一军医大学南方医院神经内科；M. Iulian、N. Ganju、SM de la Monte美国麻省总医院神经病理科参考文献1Hardy JA, Higgins GA. Alzheimer's disease:the amyloid cascade hypothesis. Science, 1992，256:184-1

19、85.2Pagenetti PR,Lis M,Klafki HW， et al. Amyloid precursor protein truncated at any of the gamma-secretase sites is not cleaved to beta-amyloid. J Neurosci Res，1996, 46:283-293.3Furuga H,Sasaki H,Gotol T， et al.Amyloid beta-protein gene duplication is not common in Alzheimer's disease:analysis by polymorphy restriction fragments.Biochem Bioply，1988，150:75-81.4Pierce JE,Trojanowski JQ, Graham DI， et al.Immunohistochemical charact-erization of amyloid precursor proteins and beta-amyloid peptide after experimental brain injury in the rat.J Neuros