协同刺激分子B7-H1和B7-H3在乳腺癌中的表达及其临床意义

1、协同刺激分子B7-H1和B7-H3在乳腺癌中的表达及其临床意义高远 , 陶敏（苏州大学附属第一人民医院 肿瘤科）摘要：目的 检测协同刺激分子B7-H1、B7-H3分子在乳腺癌组织中表达，探讨其与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系。方法 收集乳腺癌手术切除的组织59例，统计患者的病理资料及生存时间；通过免疫组织化学染色方法，分析B7-H1、B7-H3分子在乳腺癌组织中的表达，统计学分析其表达的意义。结果 B7-H1、B7-H3分子异常高表达在乳腺癌细胞上，主要表达在胞浆及胞膜。B7-H1阳性表达率47.45%，B7-H3阳性表达率57.62%。正常组织不表达或低表达B7-H1、B7-H3分子。乳腺

2、癌组织中B7-H1分子的表达和B7-H3分子的表达呈显著正相关。统计学分析显示，B7-H1在乳腺癌组织中的表达水平与肿瘤Her-2/neu表达相关（P<0.01）, 而与其它临床参数无关；B7-H3在乳腺癌组织中的表达水平与患者的肿瘤分期相关（P<0.05）, 而与其它临床参数无关。B7-H1、B7-H3在乳腺癌组织中的表达水平和浸润T淋巴细胞的数量之间关系无显著统计学意义。生存分析显示，B7-H1分子在乳腺癌中的表达与患者预后无关，而B7-H3分子的表达与患者的预后密切负相关。联合两个分子的表达分析显示，B7-H1/ B7-H3双阳性与双阴性与患者的生存时间密相关，B7-H1、B

3、7-H3双阳性患者的生存时间短于双阴性或单阴性患者，双阴性患者生存时间最长。结论 协同刺激分子B7-H1、B7-H3分子在乳腺癌组织异常表达，其表达和临床病理特征相关，表明其参与了肿瘤的进展；这两分子的表达正相关，且联合两分子的表达与患者生存时间密切相关，提示检测这两分子对乳腺癌的预后判断有重要的意义，可作为相应的生物指标应用。关键词：乳腺癌；协同刺激分子；B7-H1；B7-H3；共表达中图分类号：R394.8 文献标识码：AThe Clinical Significance of Costimulatory Molecules B7-H1 and B7-H3 in Breast Cancer

4、 and The Effects on Biological Behavior of Breast Tumor CellsGao Yuan Tao MinAbstract：Object To investigate the costimulatory molecule B7-H1 and B7-H3 expression in human breast cancer and to analyze the clinical significance . Methods：With the collection of 59 cases of breast cancer tissus from the

5、 surgery with the detailed clinical parameters, using IHC assay to detect the B7-H1 and B7-H3 expression. The clinical significances were figured by statistic software. Resuls：The results indicated that B7-H1 and B7-H3 were overexpressed in breast cancer cells, in cytoplasm and membrane. B7-H1 was e

6、xpressed in 47.45% of cases and B7-H3 in 57.62% of cases. The B7-H1 expression was positively correlated to B7-H3 expression in breast cancer tissues. The statistic analysis showed that B7-H1 expression was related to Her-2/neu expression but unrelated to other clinical parameters.B7-H3 expression w

7、as related to patients tumor stage but unrelated to other factors. Both B7-H1 and B7-H3 expression show no relevance to the T cell infiltrating in tumor rissues. The survival analysis showed that B7-H3 expression was negatively correlated to patients survival time but B7-H1; combination of B7-H1 and

8、 B7-H3 expression was significantly correlated to the survival time , patient with B7-H1 and B7-H3 double positive tissue showed the shortest survival time,while the double negative patient show the longest survival time. Conclusion：These data indicated that the co-expression of B7-H1 and B7-H3 were

9、 involved in the progression of breast cancer, these two molecules expression was positively related and the combination of them is of significant clinical value for the diagnosis and prognosis of breast cancer.Key Words:breast cancer; costimulatory molecule; B7-H1;B7-H3; co-expression乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤

10、之一，全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，50万人死于乳腺癌，其发病率逐年上升，目前国内约有47万患者，在一些城市已成为妇女恶性肿瘤发病的首位，成为妇女健康的最大威胁1 目前，手术治疗、放疗、化疗和免疫治疗等治疗模式已广泛应用于乳腺癌的临床治疗，使患者生存率得到一定程度的提高，但仍不甚理想。肿瘤的侵袭、转移和复发往往是造成乳腺癌患者死亡的主要原因，而患者机体免疫系统功能缺陷抑或对肿瘤抗原缺乏反应又是其中的关键因素23。因此，监测乳腺癌患者机体免疫功能状态的变化、探讨抗肿瘤免疫效应发挥的程度以及分析肿瘤微环境中影响抗肿瘤免疫的诸多因素，对改善患者术后预后具有重要的指导意义。B7-H1、B7-H3

11、是相继发现的两个B7家族新成员，B7-H1与表达在活化T细胞的受体相互作用，介导负性信号调节T细胞的活化和增殖；B7-H3的受体尚未得到鉴定，其对T细胞的活化增殖的调节也未有定论。因此，我们采用免疫组织化学方法，分别检测B7-H1和B7-H3在乳腺癌中的表达水平，并分析它们与临床病理特征及T淋巴细胞浸润程度的关系，同时研究它们的共表达对乳腺癌诊断和预后的意义，分析两分子之间的协同关系，以期为乳腺癌的诊断和预后新的生物指标的开发提供新的思路和依据。1. 主要试剂与材料1.1 试剂免疫组织化学所用一抗：B7-H1、B7-H3单克隆抗体由苏州大学医学生物技术研究所制备（使用终浓度为10g/ml）,

12、CD3单克隆抗体（即用型，福州迈新生物技术有限公司,以下简称福州迈新）；免疫组织化学所用二抗：HRP标记鼠/兔通用型二抗（即用型，福州迈新）。免疫组织化学常用试剂：PBS缓冲液粉剂（PBS-0060, 福州迈新）, 柠檬酸抗原修复液（MVS-0066, 福州迈新）, EDTA抗原修复液（MVS-0071, 福州迈新），BSA（Gene-tech, Co. Ltd.），苏木素体细胞快速染色液（XTS-1090, 福州迈新）, 1%盐酸-酒精分化液（自行配制），DAB显色剂（Dako, Glostrup, Denmark）, 封片用中性树胶（DAB-0033, 福州迈新），3%H2O2溶液（河北健

13、宁医药）。1.2 病例随机选取2002年至2005年在苏州大学附属第一医院普通外科接受手术治疗的女性乳腺癌患者，术后均经病理诊断，确认为浸润性导管癌。剔除伴有出血、坏死严重或蜡块片小连续切片易漏掉病变组织影响免疫组化结果病例后，共收集59例浸润性导管癌乳腺癌组织，患者年龄3485岁，中位年龄51岁。临床病理分期根据美国癌症联合会（AJCC2002）：期14例，期35例，其中 a19例，b16例， -期10例。 所有患者术前均未接受化疗及放疗，患者临床、病理资料俱全，使用查阅病史、电话随访及查阅派出所户籍登记档案进行随访，随访起始时间为接受病理确认为乳腺癌日期，随访截至日期为2009年12月20

14、日，所有死亡病例均排除肿瘤外的死亡原因。手术切除的肿瘤组织由苏州大学附属第一医院病理科经过福尔马林固定、石蜡包埋，制成蜡块后备用。同时选取相应癌旁正常组织作为对照。采用已确认B7-H1、B7-H3免疫组化染色阳性的乳腺浸润性导管癌组织分别作为上述两种抗体免疫组化染色的阳性对照组织，采用扁桃体组织作为CD3抗体免疫组化染色的阳性对照组织，以PBS代替一抗作为阴性对照。1.3 主要仪器设备全自动封闭式脱水机（TSJ-Q, 常州中威电子）, 轮转切片机（RM2135, 莱卡），全自动多功能染色机（ST5020, 莱卡），全自动封片机（CV5030, 莱卡），病理组织漂烘仪（PHY-III, 常州中威

15、电子），组织包埋机（Shandon Histocentre 3, Thermo），病理组织包埋冷冻台（BMJ-III，常州中威电子）。2. 实验方法2.1 免疫组织化学染色56烤片2h后，将切片标本进行脱蜡及梯度酒精中进行水化（二甲苯I 10min，二甲苯II 10min，二甲苯III 10min，100%无水乙醇I 3min，100%无水乙醇II 3min，95%乙醇I 3min，95%乙醇II 3min，75%乙醇3min）。处理后的切片在自来水下冲洗10min，再经蒸馏水浸洗5min后，通过电饭煲水浴加热处理30分钟，对标本进行抗原修复（其中B7-H1, CD3采用柠檬酸缓冲液进行抗原修

16、复，B7-H3采用EDTA缓冲液进行抗原修复），热修复完毕后让其自然冷却，再在自来水下冲洗5min，在蒸馏水中浸洗5min，3%H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶，于室温孵育20min，蒸馏水洗涤后，5%BSA封闭非特异性结合位点，于室温孵育15min。PBS冲洗三次，每次5分钟，然后分别加入一抗，于4ºC冰箱放置过夜。取出切片，PBS冲洗三次，每次5分钟，加入HRP标记兔/鼠通用型二抗，37ºC温箱（或者室温下）孵育30min，PBS冲洗三次，每次5分钟，洗去多余二抗，用DAB显色剂显色，切片经苏木素复染，1%盐酸-酒精分化，梯度乙醇中脱水（75%乙醇3min，95%乙醇I

17、 3min，95%乙醇II 3min，100%无水乙醇I 3min，100%无水乙醇II 3min）后，吹风机吹干无水乙醇，中性树脂封片。2.2 免疫组织化学染色结果评估2.2.1 B7-H1、B7-H3免疫组化染色结果评估按照切片中着色的肿瘤细胞所占百分比评分如下，0，无肿瘤细胞着色；1，1%30%肿瘤细胞着色；2，30%60%肿瘤细胞着色；3，>60%肿瘤细胞着色，并适当结合免疫组化染色强度10。评分为0和1的病例归为低表达组，评分为2和3的病例归为高表达组。2.2.2 CD3标记浸润T淋巴细胞的计数首先在低倍镜（x40）下区分癌灶部位和肿瘤间质部位。对于癌灶部位的浸润淋巴细胞，先在

18、低倍镜（x40）下选取5个浸润淋巴细胞最为丰富的区域，然后在标准镜（HPF, x200）下进行计数，取这5个视野的均值作为癌灶部位浸润淋巴细胞的数量，浸润淋巴细胞数量60/HPF定义为低度浸润，浸润淋巴细胞数量>60/HPF定义为高度浸润；对于肿瘤间质部位的浸润淋巴细胞，按照如下标准：0，无浸润；1，低度浸润；2，中度浸润；3，强度浸润这四个等级进行区分，其中0和1归为低度浸润，2和3归为高度浸润11-13。以上评分工作由两位病理医师独立完成，取两者评分均值纳入统计分析。2.3 统计学处理将调查数据和实验检测数据双遍录入Epidata3.0数据库中，经双遍核查后，转成SARS 9.12统

19、计软件包进行分析，计量资料以均数±标准差()表示，采用两样本均数t检验，组间比较采用2检验，多组间率的趋势采用Cochran-Armitage test趋势检验，相关性检验采用Spearman等级相关分析。生存资料分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。3. 结果3.1 B7-H1和B7-H3分子在乳腺癌组织中异常高表达免疫组织化学分析显示，B7-H1和 B7-H3（图1）主要表达在肿瘤细胞的胞浆及胞膜。正常组织不表达或低表达B7-H1、B7-H3分子。根据评分结果，所有59例样本可分为：B7-H1低表达，31例，B7-H1高表达，28例，B7-H1高表达47.45

20、%；B7-H3低表达，25例；B7-H3高表达，34例，B7-H3高表达57.62%。乳腺癌组织较正常组织均高表达B7-H1、B7-H3分子（P<0.05）(图2)。3.2 B7-H1分子和B7-H3分子在乳腺癌中正相关共表达统计学分析免疫组化染色结果显示，在59例乳腺癌组织中，B7-H1分子的表达和B7-H3分子的表达呈显著正相关（P<0.01）（图3）。3.3 B7-H1分子和B7-H3分子在乳腺癌组织中的表达水平和患者临床病理参数的关系统计学分析显示，B7-H1在乳腺癌组织中的表达水平与肿瘤Her-2/neu表达相关（P<0.05）, Her-2/neu阳性患者B7-H

21、1较阴性患者高表达，而与其它临床参数无关；B7-H3在乳腺癌组织中的表达水平与患者的肿瘤分期相关（P<0.05）, 随着肿瘤的进展B7-H3分子高表达例数增加，而与其它临床参数无关（表1）。3.4 B7-H1和B7-H3分子在乳腺癌组织中的表达水平和浸润T淋巴细胞数量的关系统计分析显示，B7-H1在乳腺癌组织中的表达水平和浸润T淋巴细胞的数量之间关系无显著统计学意义。B7-H3在乳腺癌组织中的表达水平和浸润T淋巴细胞的数量亦无显著统计学意义（表2）。3.5 B7-H1分子和B7-H3分子在乳腺癌中的表达和患者预后之间的关系生存分析显示，B7-H1分子在乳腺癌中的表达与患者预后的关系无显著

22、统计学意义，但B7-H1低表达患者其生存率曲线高于B7-H1高表达患者，显示了B7-H1表达与患者预后负相关的趋势；而B7-H3分子的表达与患者的预后密切负相关，有显著统计学意义。联合两个分子的表达分析显示，B7-H1/B7-H3双阳性与双阴性与患者的生存时间密相关，B7-H1B7-H3双阳性患者的生存时间短于双阴性或单阴性患者，双阴性患者生存时间最长（图4）。表1. B7-H1和B7-H3在乳腺癌中的表达及其与临床病理参数的关系临 床病理参数例数B7-H1B7-H3 低表达高表达P 低表达高表达P年龄51321517>0.051319>0.05>512716111215肿瘤

23、大小(cm)2.5361620>0.051620>0.05>2.523158914淋巴结转移无311615>0.051516>0.05有2815131018病理分期I1486>0.05104<0.05IIa19109811IIb1697313III-IV105546ER阴性231310>0.05815>0.05阳性3621151719PR阴性271116>0.051017>0.05阳性3220121517Her2/neu阴性281810<0.051315>0.05阳性3113181219P53阴性371918>

24、0.051918>0.05阳性221210616注：*P<0.05为差异有统计学意义。图1 B7-H1和B7-H3分子在乳腺癌组织的表达图中乳腺癌组织中褐色颗粒为B7-H1、B7-H3阳性染色，可见染色呈现在细胞膜及胞浆中，细胞核染色呈蓝色。图2 乳腺癌组织及正常组织表达B7-H1和B7-H3分子图3 B7-H1和B7-H3在乳腺癌组织中表达的关系Speraman等级相关分析显示，乳腺浸润性导管癌组织中B7-H1和B7-H3表达水平呈正相关(P=0.009)。表2. B7-H1和B7-H3在乳腺癌中的表达与浸润T淋巴细胞的关系CD3+T细胞例数B7-H1表达B7-H3表达低高P值低

25、高P值肿瘤基质低度浸润3315180.16712210.216高度浸润2616101313肿瘤中心低度浸润3319140.27117160.090高度浸润261214818Total5931282534B7-H1在乳腺浸润性导管癌中的表达与CD3+T淋巴细胞浸润程度的关系(P>0.05)；B7-H3在乳腺浸润性导管癌中的表达与CD3+T淋巴细胞浸润程度的关系(P>0.05)；图4 B7-H1和B7-H3在乳腺癌中的表达与患者生存时间的关系A，B7-H1在乳腺浸润性导管癌中的表达与患者预后的关系(P>0.05)；B，B7-H3在乳腺浸润性导管癌中的表达与患者预后的关系(P<

26、;0.05)。C, B7-H1和B7-H3联合分析与患者预后的关系(Both negative VS both positive ：P<0.05;Both negative VS B7-H1+B7-H3-：P<0.05;Both negative VS B7-H1-B7-H3+：P<0.05; Both positive VS B7-H1+B7-H3-：P<0.05;Both positive VS B7-H1-B7-H3+：P<0.05;4. 讨论Ghebeh4等发现，PD-L1在乳腺癌肿瘤细胞中的表达水平和肿瘤的组织学分型、雌激素受体及孕酮受体表达水平显著相关

27、。通过冰冻切片免疫组化双标记法，Ghebeh5等进一步证实，乳腺癌组织中PD-L1 T细胞和Foxp3 Treg 在数量上呈显著正相关，并且Foxp3 Treg、PD-L1 T细胞及PD-1 T细胞在乳腺癌中的浸润程度同时与患者的组织学分型、孕酮受体表达水平显著相关，这一结果提示诸多负性调控的TILs在肿瘤中的浸润，在相当程度上弱化了肿瘤细胞的免疫原性，因此，PD-1/PD-L1信号可作为乳腺癌免疫治疗的潜在分子靶标。Hamanishi等6在卵巢癌中发现肿瘤细胞PD-L1的表达水平和CD8+T的浸润程度负相关，且PD-L1表达水平和患者预后负相关，而CD8+T的浸润程度和患者预后正相关。本文研

28、究发现，B7-H1在乳腺癌组织中较正常组织异常高表达,其表达水平与肿瘤Her-2/neu阳性正相关， 而与其它临床参数无关。B7-H1在乳腺癌组织中的表达水平和浸润T淋巴细胞的数量之间并无显著关， B7-H1分子的表达和乳腺癌患者的生存时间之间相关性虽无显著统计学意义，但趋势显示B7-H1低表达患者生存率高于高表达患者。这提示B7-H1分子在乳腺癌细胞上的异常高表达可能并非通过直接负性调控T细胞的增殖而参与肿瘤的免疫逃逸，其在肿瘤预后的价值有待进一步扩大样本深入分析。到目前为止，通过免疫组织化学的检测方法，已先后发现B7-H3蛋白在诸多肿瘤组织中高表达。Wu等7发现，58.8%的胃癌组织中B7

29、-H3高表达，同时B7-H3的表达水平和患者预后显著相关。Sun等8检测了70例非小细胞肺癌（NSCLC）组织中B7-H3的表达，发现有26例肺癌高表达B7-H3，同时高表达B7-H3的肺癌组织中TILs的数量较低表达B7-H3的肺癌组织中显著降低。提示B7-H3在肿瘤免疫应答中起负性调控作用。Roth，Zang等9-10报道，B7-H3在前列腺癌中高表达，且其在前列腺癌中的表达水平与Gleason Score, 是否累及精囊腺，前列腺以外扩散以及是否存在手术切缘等临床参数显著相关。同时，高表达B7-H3的患者，其预后显著差于中度表达和弱表达的患者，B7-H3表达水平在诸多临床参数中，是一个独

30、立的预测患者预后的风险因素。提示B7-H3在前列腺癌发生、发展过程中发挥重要作用。本文研究发现，B7-H3在乳腺癌组织中的表达水平与患者的肿瘤分期（P<0.05）密切相关, 而与其它临床参数无关。同时，B7-H3在乳腺癌组织中的表达水平和浸润T淋巴细胞的数量无显著相关性，而与患者的生存时间显著负相关，这提示肿瘤细胞可通过异常表达B7-H3，参与肿瘤的进展和分化，可作为乳腺癌预后判断的生物学指标。同时，B7-H1和B7-H3分子的表达在乳腺癌组织中呈现正相关，而且两分子双阳性患者的生存时间较单阳性和双阴性的更为短，这提示联合这两个分子可以更为准确的分析患者的预后，也暗示B7-H1信号和B7

31、-H3信号在肿瘤免疫应答中可能存在协同作用。本部分研究表明，B7-H1、B7-H3分子在乳腺癌的异常高表达，参与了乳腺癌的进展，进而影响了乳腺癌患者的预后，因此，通过干预这些负性调控分子介导的信号途径，有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。参考文献：1. Jemal A, R Siegel, E Ward, et al. Cancer statistics, 2007. CA Cancer J Clin 2007, 57:43-66.2. Gupta GP, Massague J. Cancer metastasis: building a framework. Cell,2006,127(4):67

32、9-695.3. Hurley J, Franco S, Gomez-Fernandez C et al. Breast cancer and human immunodeficiency virus: a report of 20 cases. Clin Breast Cancer. 2001 Oct;2(3):215-20.4. Ghebeh H, S Mohammed, A Al-Omair, et al. The B7-H1 (PD-L1) T lymphocyte-inhibitory molecule is expressed in breast cancer patients with infiltrating ductal carcinoma: correlation with important high-risk prognostic factors. Neoplasia 2006, 8:190-198.5. Ghebeh H, E Barhoush, A T