RHBV疫苗接种引起的特异性细胞免疫反应(1)

1、    RHBV疫苗接种引起的特异性细胞免疫反应(1)    】 目的 研究小鼠免疫接种基因重组乙型肝炎表面抗原疫苗(recombinant HBV surface vaccine，rHBs)产生的特异性细胞免疫反应。方法 40只BALB/c小鼠随机分为0.65、1.25、2.5、5g 4组，腹腔分别接种0.65、1.25、2.5、5g的rHBs 1次或2次。初次免疫后4周或加强免疫后2周分离小鼠脾T淋巴细胞，分别进行脾T淋巴细胞释放IFNr、IL-2及细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte

2、，CTL)实验；脾T淋巴细胞释放实验：用10g/ml rHBs刺激脾T淋巴细胞，3天后用ELISA方法检测培养液中IL-2及IFNr的浓度。CTL实验，脾T淋巴细胞用特异性多肽刺激，用51Cr释放实验检测CTL。结果 只接受单次免疫的0.65、1.25、2.5、5g组小鼠脾T淋巴细胞释放的IL-2分别为5.48±8.88、9.28±6.98、28.53±14.32、64.69±20.88pg/ml，释放的IFNr分别为8.22±8.61、9.89±9.34、20.27±15.50、30.77±22.12pg/ml。

3、接受加强免疫的0.65、1.25、2.5、5g组小鼠脾T淋巴细胞释放的IL-2分别为5.75±5.04、102.53±67.52、177.13±91.12、332.10±124.31pg/ml，释放的IFNr分别为3.63±4.42、28.33±13.04、59.66±25.75、80.73±19.30pg/ml。CTL反应的靶细胞自然释放率为28.76%±13.45%；加强免疫组小鼠0.65、1.25、2.5、5组小鼠，CTL特异性释放率分别为(42.36±19.32)%、(91.21

4、7;22.97)%、(69.25±24.13)%、(51.49±21.661)%；只接受1次免疫接种的小鼠，其脾淋巴细胞特异性CTL特异性释放率分别为(32.27±15.35)%、(56.28±24.35)%、(44.34±18.65)%、(40.76±56)%。结论 小鼠接种rHBs后，脾T淋巴细胞产生特异性CTL反应，并特异性分泌IL-2、IFNr，反应强度与是否加强免疫及接种的剂量密切相关。    【关键词】 HBV疫苗；免疫接种；小鼠；脾T淋巴细胞；IL-2；IFNr；CTL反应

5、0;   The cellular immune response to recombinant HBV vaccine        【Abstract】 Objective Hepatitis B virus(HBV) surface vaccine(rHBs) specific MHC class I-restricted cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses induced by immunization with rHBs in mu

6、rine were assayed.Methods BALB/c(H-2d) murine were injected intraperitoneal(i.p.)with rHBs at doses ranging from 0-6 g and boosted after 2 weeks. 4 weeks after the last immunization，to measure the IL-2 and IFNr，spleen lymphocytes were harvested and restimulated with rHBs in experimental group o

7、r with PBS as control，4 weeks later after the last vaccination. For CTL assay，spleen cells were restimulated in vitro with specific peptides，which represents a Ld-restricted CTL epitope of the S-protein in H-2d BALB/c murine. The specific cytotoxic reactivity of in vivo primed and in vitro rest

8、imulated cells was tested against P815 cells impulsed with specific peptides and labeled with 51Cr. 4 hours release assay of 51Cr was performed. Results 2 weeks after primary vaccination，the IL-2 were 5.48±8.88，9.28±6.98，28.53±14.32，64.69±20.88 respectively；IFNr were 8.22±8.

9、61，9.89±9.34，20.27±15.50，30.77±22.12 separately. 2 weeks after boost vaccination，the IL-2 were 5.75±5.04，102.53±67.52，177.13±91.12，332.10±124.31 separately；IFNr were 3.63±4.42，28.33±13.04，59.66±25.75，80.73±19.30 separately. For CTL assay，the per

10、centages of specific release of the mouse spleen lymphocyte in group 0.65 g、1.25 g、2.5 g、5 g were 42.36%±19.32%、91.21%±22.97%、69.25%±24.13%、51.49%±21.661%，respectively. For the mouse receive only priming vaccination，the percentages of specific release of the mouse spleen lymphocy

11、te in group 0.65、1.25、2.5、5 were 32.27%±15.35%、56.28%±24.35%、44.34%±18.65%、40.76±56% respectively. Conclusion Injection with rHBs efficiently prime MHC-I restricted CTL response to the S-HBsAg in BALB/c(H-2d) murine，which was enhanced by boosting injection.    

12、;    【Key words】 rHBs；murine；immunization；spleen T lymphocytes；IL-2；IFNr；CTL reaction         乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一种严重危害人体健康的常见疾病，全世界有3.5亿HBV感染者。接种基因重组HBV表面抗原疫苗(recombinant HBV surface vaccine，rHBs)能产生保护性抗体，已广泛用于预防HBV感染。然而抗HBV特异

13、性细胞免疫反应决定HBV感染的预后，细胞免疫反应不足，即使抗HBV特异性体液免疫反应较强，也常导致HBV持续感染，清除体内已有的HBV、治疗HBV感染需较强的抗HBV特异性细胞免疫反应。        接种rHBs能否产生HBV特异性细胞免疫反应，能否用于治疗HBV感染还不十分清楚。笔者给小鼠接种rHBs，研究其脾T淋巴细胞能否产生特异性CTL反应，能否释放特异性细胞因子，对接种rHBs产生的特异性细胞免疫反应进行定量及功能分析。       &

14、#160;1 资料与方法        1.1 试剂 rHBs含HBV表面抗原preS2/S，酵母基因重组产品，Merck公司生产。合成的特异性多肽IPQSLDSWWTSL(S28-39)，为H-2d BALB/c小鼠Ld限制rHBs-CTL表位(Saibaisheng公司生产)，以50 mg/ml浓度溶解在70%乙腈或0.1% DMSO储存液中，临用前以培养液稀释。Na251CrO4购自中国同位素公司。IL-2及r-IFN检测试剂盒：U-CyTech公司。     

15、;   1.2 实验动物 BALB/c小鼠。610周龄，SPF级。        1.3 方法        1.3.1 BALB/c小鼠免疫接种 小鼠按以下分组，腹腔内分别接种不同剂量的rHBs，一半小鼠2周后加强免疫接种1次，另一半只接种1次：0.65组(10只)，接种0.65g的rHBs；1.25组(10只)，接种1.25g的rHBs；2.5组(10只)，接种2.5g的rHBs；5组(10只)，接种5

16、g的rHBs。        1.3.2 小鼠脾T淋巴细胞分离培养 接种后2周，氯仿麻醉小鼠，脱颈处死小鼠，分离脾细胞，8.3% NH4Cl/0.17mol/LTris (pH 7.4)37作用10min去除红细胞，过玻璃毛柱，收集T淋巴细胞；用100：1含10% 胎牛血清、5×10-5mol/L二硫苏糖醇的DMEM完全培养液，以5×105/well浓度接种在96孔细胞培养板上，每例作3个重复孔。        &#

17、160;   【摘】目的研究小鼠免疫接种基因重组乙型肝炎表面抗原疫苗(recombinant HBV surface vaccine，rHBs)产生的特         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。        1.3.3 IL-2、IFNr释放实验

18、 小鼠脾T淋巴细胞，用10g/ml rHBs体外刺激3天后，用U-CyTech公司的ELISA检测试剂盒测定培养上清的IL-2及FNr浓度。    1.3.4 51Cr释放CTL反应 靶细胞，P815细胞用特异性多肽处理，用100ul Na251CrO4在二氧化碳培养箱37标记h。效应细胞，用含10% FCS的DMEM培养液悬浮小鼠脾细胞，加巯基乙醇至5×10-5M、小鼠IL-2至5u/ml，二氧化碳培养箱内培养5天后，培养液冲洗次，按100:1、50:1与104标记的靶细胞在96孔细胞培养板上反应h，每个实验对象检测3次；离心后，取100ul

19、上清用r-记数计检测放射性，用以下公式计算特异性释放率，CTL特异性释放率=(实验组释放的量-自然释放的量)/(最大释放的量-自然释放的量)。    1.4 统计学处理 CTL特异性释放率、培养上清的IL-2及r-IFN浓度以平均数±标准差来表示(x±s)，不同组小鼠脾T淋巴细胞释放的IL-2及IFNr比较、CTL特异性释放率比较均用t检验。        2 结果       

20、0;2.1 小鼠脾T淋巴细胞特异性CTL反应 只接受1次免疫接种的小鼠脾淋巴细胞特异性CTL反应，0.65、1.25、2.5、5组小鼠CTL特异性释放率分别为(32.27±15.35)%、(56.28±24.35)%、(44.34±18.65)%、(40.76±56)%。        接受2次免疫接种的小鼠脾淋巴细胞与未经特异性多肽作用的靶细胞反应，CTL特异性释放率分别为：(42.36±19.32)%、(91.21±22.97)%、(69.25

21、7;24.13)%、(51.49±21.661)%。            2.2 小鼠脾T淋巴细胞释放的IL-2和IFN-r 结果见表1。表1 各组小鼠初次免疫及加强免疫脾T淋巴细胞释放的IL-2和FN-r    Tab 1 The production of IL-2 and IFN-r from the spleen T lymphocyte from the mouse boost vaccinated with rH

22、Bs （ng/L，x±s，n=40）Notes: vs control 0.05；*group*P<<0.01    3 讨论        HBV感染是一种严重危害人体健康的常见疾病，全世界有3.5亿HBV感染者。多数成年人感染HBV后，机体能够自动清除HBV，表现出一种急性、自限性病程，而只有5%的成年人感染HBV后，虽然有强烈的抗HBV特异性体液免疫反应，但由于抗HBV特异性细胞免疫反应较差、机体免疫反应不能清除HBV而成为慢性HBV感染，其中部分

23、患者最终发展成为肝硬化、肝癌。目前治疗HBV感染主是干扰素(interfern，IFN)及拉米夫定(lamivudine)，但只对转氨酶增高的部分患者有效，而且存在副作用较多、停药后易复发等缺陷。疫苗接种能激发机体产生特异性免疫反应，是预防及治疗病原微生物感染简单有效的方法；rHBs接种能产生强烈的抗HBV特异性体液免疫反应，很早就用于预防HBV感染，但是接种rHBs能否产生较强的抗HBV特异性细胞免疫反应，能否治疗HBV感染还不十分清楚。笔者给小鼠接种rHBs，研究其脾T淋巴细胞能否产生特异性淋巴细胞CTL反应，能否释放特异性细胞因子，对接种rHBs产生的特异性细胞免疫反应进行定量及功能分析

24、16。        研究发现，接种rHBs的小鼠脾T淋巴细胞在体外再受rHBs或HBV特异性多肽刺激后：(1) 特异性CTL反应 各实验组特异性CTL释放率以1.25组的最大，0.65组的最小。提示随着rHBs接种剂量增加，开始时特异性CTL反应逐步增强，1.25g rHBs接种剂量的CTL特异性释放率达到最高值，进一步增加接种剂量并不能增强特异性CTL反应，CTL特异性释放率反而降低。同一剂量组的小鼠，加强免疫组的CTL特异性释放率普遍比单次免疫组的高，二者差异有显著性，表明加强免疫也能增强特异性CTL反应。(

25、2) IL-2、IFN-r的分泌是剂量依赖性的，加强免疫或增加接种剂量使脾T淋巴细胞特异性CTL反应、IL-2，IFN-r的分泌显著增加；(3) CTL反应、IL-2、IFN-r的分泌是HBV特异性的：不论是哪一个剂量组，不论是加强免疫还是单次免疫，淋巴细胞CTL反应中，小鼠脾T淋巴细胞均在体外用HBV特异性多肽刺激，检测的是HBV特异性CTL释放率；而小鼠脾T淋巴细胞分泌IL-2、IFNr的实验，小鼠脾T淋巴细胞均在体外用rHBs刺激，检测的是HBV特异性IL-2、IFNr释放。(4)小鼠脾T淋巴细胞特异性CTL反应强度与其分泌的IL-2、IFNr有密切的相关性，CTL反应较强的组的IL-2

26、、IFNr分泌也较高，反之亦然。IL-2、IFN-r主由CD4( )的I型辅助T淋巴细胞(helper spleen lymphocyte type I subtype)分泌；CTL实验反映的是CD8( )T淋巴细胞的功能，CD4( )与CD8( )T淋巴细胞在抗原呈递、免疫信号传递等免疫反应环节中，相互依赖、相互作用，CD4( )T淋巴细胞通过分泌的淋巴细胞因子调节CTL功能，而CTL也分泌淋巴细胞因子；这可以解释小鼠脾T淋巴细胞特异性CTL反应与IL-2、IFN-r分泌二者之间密切关系。        机体免疫

27、反应能够清除HBV的急性、自限性HBV感染者，其体内存在抗HBV的多克隆、多特异性细胞免疫反应，包括CD4( )的I型辅助T淋巴细胞(T helper lymphocyte，Th1)分泌的细胞因子(IFNr，TNFa，IL-2)产生的非细胞溶解性抗HBV作用及CD8( )的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)对HBV感染肝细胞的细胞溶解性抗HBV作用。研究发现，在淋巴细胞浸润肝脏组织达高峰之前，机体已开始清除体内的HBV，而且与IFNr分泌高峰的时相一致，提示I型淋巴细胞分泌的细胞因子产生的非细胞溶解性抗HBV作用在CTL对HBV感染肝细胞的细胞溶解性抗HB

28、V作用之前即发挥作用，在机体清除HBV过程中起着重作用。但在抑制、清除肝细胞胞浆及肝细胞胞核的HBV共价、闭合、环状DNA(covalently colsed circular DNA，cccDNA)的复制、清除体内HBV、治疗HBV感染的过程中，CTL的细胞溶解性抗HBV作用则起着不可替代的作用。        对于机体免疫反应不能清除体内HBV的HBV慢性感染者，抗HBV特异性细胞免疫反应较弱，提示增强抗HBV特异性细胞免疫反应有助于清除体内的HBV，接种rHBs可以用于治疗HBV感染。现在临床上使用的抗HBV

29、特异性免疫球蛋白对预防HBV感染有效，但对治疗体内已感染的HBV无效79。        由于HBV感染引起的免疫反应不能清除HBV，所以开始人们对于接种rHBs治疗HBV感染抱怀疑态度。然而国外临床实验证实，给HBV感染者接种rHBs，通过提高抗HBV特异性细胞免疫反应，清除其体内的HBV，达到治疗HBV慢性肝炎的目的。法国Stanislas等教授对接种rHBs治疗HBV慢性肝炎进行了大范围、多中心、随机、对照研究：实验组HBV慢性肝炎患者接受5次20g的rHBs皮下接种，发现与未接受治疗的对照组相比，实验组患者

30、血清HBV DNA转阴率明显较高，特别是接种前血清HBV DNA含量高于200pg/ml的患者，其血清HBV DNA转阴率更高；实验组患者HBe/anti-HBe血清转换率为13.3%，而对照组只有3.6%。表明接种rHBs能够抑制HBV慢性肝炎患者体内HBV复制，降低体内HBV含量，证实接种rHBs能提高抗HBV特异性细胞免疫反应，确实能够治疗HBV感染。            【摘】目的研究小鼠免疫接种基因重组乙型肝炎表面抗原疫苗(recombinant HBV surf

31、ace vaccine，rHBs)产生的特         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。        HBV感染引起的免疫反应不能清除HBV，皮下接种较预防剂量高的rHBs能引起特异性细胞免疫反应，能用于治疗HBV感染，究其原因可能与以下原因有关：(1) 接种途径不同，研究证实，

32、腹腔或皮下含有较多的抗原提呈细胞树突状细胞(dentritic cell，DC)，而DC是目前已知的抗原提呈功能最强的抗原提呈细胞，腹腔或皮下接种能引起较强的特异性细胞免疫反应。(2) 接种剂量不同，细胞免疫反应强度与接种剂量有关，腹腔或皮下接种较预防剂量高的rHBs能引起明显的特异性细胞免疫反应，小鼠0.125g的接种剂量相当于人10g的免疫预防接种剂量；Stanislas等教授采用的是给HBV患者5次20g的rHBs皮下接种，而一般预防HBV感染，3次510g的rHBs皮下接种就能得到满意的预防效果；笔者的研究也证实，接种rHBs的小鼠脾T淋巴细胞在体外再受rHBs刺激后，脾T淋巴细胞特异

33、性CTL反应、IL-2、IFN-r的分泌是剂量依赖性的，加强免疫或增加接种剂量使脾T淋巴细胞特异性CTL反应、IL-2，IFN-r的分泌显著增加10，11。        笔者的研究发现，BALB/c小鼠腹腔接种rHBs后2周，其脾淋巴细胞即产生抗HBV特异性CTL反应并分泌Th1淋巴细胞因子，提示接种rHBs有助于提高HBV慢性感染者抗HBV特异性细胞免疫反应，有可能用于治疗已有的HBV感染，为治疗HBV感染提供了一种新的免疫治疗方法。【参考文献】    1 Bhatnag

34、er PK，Papas E，Blum HE，et al. Immune response to synthetic peptic analogues of hepatitis B surface antigen specific for the “a” determinant. Proc Natl Acad Sci USA，1982，79(6): 4400-4404.    2 Waters JA，ORourker SM，Richardson SC，et al. Qualitative analysis of the humoral immune res

35、ponse to the “a” determinant of HBs antigen after inoculation with plasma-derived or recombinant vaccine. J Med Virol，1987，21(1): 155-160.    3 Neurath AR，Kent SBH，Parker K，et al. Antibodies to a synthetic peptide from the preS 120-145 region of the hepatitis B virus en

36、velope are virus-neutralizing. Vaccine，1986，4(1): 35-37.    4 Neurath AR，Kent SBH，Strick N，et al. Identification and chemical synthesis of a host cell binding site on hepatitis B virus. Cell，1986，46(2): 429-436.    5 Guidotti LG，Ando MV，Hobbs T，et al. Cytotoxic T lymphocytes inhibit hepatits B virus gene expression by a noncytolytic mechanism in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(