IL_13对正常人表皮成纤维细胞产生炎症因子作用的实验研究

1、·论著·皮肤及内脏组织器官纤维化和硬化是硬皮病的主要病理学改变,导致这种病理改变的原因和机制尚未明确。IL-13是一种前炎症性细胞因子,由活化的T细胞、肥大细胞产生,能促进其他炎症性细胞因子的分泌和黏附分子的表达,调节正常皮肤成纤维细胞胶原蛋白的自身稳定性。在系统性硬皮病(SSc早期阶段可能促进纤维组织增生及内皮细胞的增殖。IL-6参与皮肤结缔组织代谢,可能是通过刺激成纤维细胞胶原蛋白和氨基葡聚糖的合成而在硬皮病发生机制中起作用。IL-8为中性粒细胞、T细胞的趋化因子,目前研究表明,IL-8除了参与免疫调节外,还参与胶原的更新过程1。巨噬细胞趋化蛋白-1 (MCP-1是CC

2、家族中一种特异的趋化因子,能够促使单核/巨噬细胞由外周迁移至炎症部位聚集并激活,从而介导炎症。嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin是一种-趋化因子,为CC型化学趋化因子家族的成员,是一种嗜酸性粒细胞选择性的趋化剂。为进一IL-13对正常人表皮成纤维细胞产生炎症因子作用的实验研究杨高云1乌日娜2*赵雅兰2崔文颖1王莉1钱革3【摘要】目的探讨白介素-13(IL-13对正常人表皮成纤维细胞(NHDF产生炎症因子的影响。方法使用不同浓度IL-13(0.1、1、10ng/ml刺激体外培养的NHDF,应用ELISA方法检测IL-13刺激NHDF24h后,白介素-6 (IL-6,白介素-8(IL-8,巨噬细

3、胞趋化蛋白-1(MCP-1和嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin的蛋白表达水平。结果0.1ng/ml IL-13刺激下,IL-6、MCP-1和Eotaxin的蛋白表达水平分别为(727.33±39.88pg/ml、(414.67±13.01pg/ml、(124.67±8.67pg/ml;1ng/ml IL-13刺激下,分别为(1222.50±49.95pg/ml、(705.33±25.15pg/ml、(205.33±16.59pg/ml; 10ng/ml IL-13刺激下,分别为(1502.83±5.31pg/ml、(132

4、9.17±56.08pg/ml、(457.50±15.32pg/ml,均明显高于对照组(283.50±15.86pg/ml、(205.17±3.76pg/ml、(13.50±5.01pg/ml,P<0.05或0.01,并具有浓度依赖性。IL-8蛋白表达水平与对照组无显著性差异(P>0.05。结论IL-13可刺激NHDF产生IL-6、MCP-1和Eotaxin,这些炎症因子的大量表达可能参与了IL-13在皮肤组织纤维化过程中的病理性作用。【关键词】白介素-13正常人表皮成纤维细胞皮肤纤维化The study of inflammati

5、on-related cytokines expression on interleukin-13treated normal human dermalfibroblastsYANG Gao-yun,WU ri-na,ZHAO Ya-lan,et al(Department of Dermatology,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing100050【Abstract】Objective To investigate the effect of interleukin-13(IL-13on inflamm

6、ation related cytokines production in normal human dermal fibroblasts(NHDF.Methods In vitro cultured NHDF with different concentrations of IL-13(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/mlfor24hours,the ELISA was applied to measure the protein level of interleukin-6(IL-6, interleukin-8(IL-8,monocyte-chemoattracting pro

7、tein-1(MCP-1and Eotaxin in the supernatant.Results IL-6, MCP-1and Eotaxin protein productions were significantly and dose dependently increased in IL-13treated NHDF(P< 0.05,while IL-8production was not significantly increased(P>0.05.Conclusions IL-13can stimulate NHDF producing more IL-6,MCP-1

8、and Eotaxin.These inflammation related cytokines may be involved in the pathogenesis of skin fibrosis.【Key words】Interleukin-13(IL-13Normal human dermal fibroblasts(NHDFSkin fibrosis基金项目:教育部留学回国人员启动基金1.首都医科大学附属北京友谊医院皮肤科(邮编1000502.呼和浩特,内蒙古医学院附属医院皮肤科3.郑州,河南省人民医院皮肤科*通讯作者炎症因子IL-13(ng/ml 对照组0.1110MCP-141

9、4.67±13.01*705.33±25.15*1329.17±56.08*205.17±3.76Eotaxin 124.67±8.67205.33±16.59*457.50±15.32*13.50±5.01IL-6727.33±39.88*1222.50±49.95*1502.83±5.31*283.50±15.86IL-824.83±1.4728.17±3.4926.17±2.1425.67±1.63与对照组比较,*P <0.

10、05,*P <0.01步探讨IL-13在皮肤纤维化病理过程中的作用机制,我们于2008年1月至2009年6月采用ELISA 方法检测了不同浓度的IL-13对正常人表皮成纤维细胞(NHDF 作用后以上炎症因子的蛋白表达水平,报告如下。材料与方法一、材料及仪器NHDF 细胞购自美国标准菌种收藏中心(ATCC ,IL-13购自美国R&D 公司,新生牛血清购自美国Invitrogen 公司,DMEM 培养基购自美国Gibco 公司,CO 2恒温培养箱(德国Heraeus,IX70型倒置显微镜(日本OLYM-PUS 公司,ELISA 试剂盒(Biosource 公司生产,上海森雄科技实业有

11、限公司分装,MR4100型酶联免疫分析仪(美国Dynatech 公司。二、方法1.NHDF 的培养:采用细胞体外培养法,将正常人表皮成纤维细胞均匀接种于25cm 2培养瓶,以含15%FBS 的DMEM 培养液培养,待其长至80%融合,消化液消化,按12的比例传代接种细胞。传代细胞以10%FBS 的DMEM 培养液维持。每23天换液1次,生长至近完全融合进行传代。实验选用36代的细胞,将细胞接种于6孔板中,每孔2×105细胞,待其长至80%融合,更新培养液,进行刺激观察等。2.IL-13的配制及实验分组:将5ml 含10ng/ml IL-13的培养液放在50ml 离心管中,加入45ml

12、 DMEM ,使其混匀,配置成1ng/ml 的培养液。再取5ml 含1ng/ml IL-13的培养液放在50ml 离心管中,加入45ml DMEM ,使其混匀,配置成含0.1ng/ml IL-13的培养液。用配置好的3种浓度的培养液(实验组以及不含IL-13的培养液(对照组置换6孔板中原有的培养液,进行实验观察,作用24h ,分别收集4组培养上清液进行ELISA 分析。3.IL-6、IL-8、MCP-1和Eotaxin 蛋白表达水平的检测:采用双抗体夹心-ELISA 方法对各组细胞上清液进行检测。具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行,最后用酶标仪490nm 处读数,并将数值按照标准曲线转换成相应

13、浓度值。三、统计学方法应用SPSS13.0统计软件,数据以x 軃±s 表示,两两均数的比较采用独立样本t 检验,P <0.05为有显著性差异。结果一、NHDF 培养与鉴定倒置显微镜下可见正常的NHDF 呈梭形,胞质丰富,胞核较大,生长旺盛密集,相互连接成片,呈涡轮或螺旋形,细胞晕清晰,相态规则,胞体饱满。二、IL-13对NHDF 产生MCP-1、Eotaxin 、IL-6和IL-8蛋白的影响NHDF 经不同浓度IL-13刺激后,MCP-1、Eo -taxin 和IL-6蛋白表达水平(pg/ml 明显高于对照组,并且随着IL-13浓度的增加,MCP-1、Eotaxin 和IL-6

14、蛋白表达水平也呈上升趋势;IL-8的表达与对照组比较无显著性差异(P >0.05,见表1。讨论研究表明,胶原是硬皮病皮肤及内脏纤维化细胞外基质沉积物中最主要的成分,而人体合成胶原的最主要场所是成纤维细胞,故成纤维细胞的数量及活性与胶原的合成密切相关2。IL-13主要由活化的Th2细胞产生,活化的单核细胞、CD 8+细胞、B 细胞等也可分泌少量的IL-13。人IL-13基因位于染色体5q23-313。IL-13是一种前炎症性细胞因子,能促进其他炎症性细胞因子的表1不同浓度IL-13刺激后MCP-1、Eotaxin 、IL-6和IL-8蛋白的表达情况(x 軃±s ,pg/ml 分泌

15、和黏附分子的表达,调节正常皮肤成纤维细胞胶原蛋白的自身稳定性4。在SSc早期阶段可促进纤维组织增生及内皮细胞的增殖。IL-6参与皮肤结缔组织代谢,可能是通过刺激成纤维细胞胶原蛋白和氨基葡聚糖的合成而在硬皮病发生机制中起作用。IL-8为中性粒细胞、T细胞的趋化因子。目前研究表明,IL-8除了参与免疫调节外,还参与胶原的更新过程,IL-8可能参与了硬皮病的病理过程。在SSc发生过程中这两种细胞因子与单核细胞浸润、胶原蛋白束的沉积有关。但它们不是成纤维细胞的丝裂原,对成纤维细胞的增殖无直接影响。成纤维细胞在基础状态及未受刺激条件下产生的IL-6、IL-8很难被检测5。本研究采用IL-13刺激后,正常

16、皮肤成纤维细胞产生的IL-6明显升高,而IL-8的升高不明显。MCP-1属于趋化因子家族CC亚家族中的重要成员,广泛参与炎症及免疫反应过程,对硬皮病巨噬细胞的募集和活化起着重要作用6。但目前有关IL-13对组织细胞产生MCP-1影响的报道不多。本研究显示,IL-13刺激NHDF后,其MCP-1的浓度明显高于正常对照组。嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin是具有73个氨基酸的多肽。Eotaxin基因位于第17号染色体的q21.1-21.2,有3个外显子(长度分别为132bP、112bp 和542bp7。Eotaxin是一种趋化因子,为CC化学趋化因子家族的成员,现已发现的成员有Eotax-in-

17、1、2和3。研究显示,它们在一些过敏性和炎症性疾病中起重要作用8。Eotaxin与其他趋化因子一样,活性形式为单体。单体为三维结构具有趋化因子典型的折叠特征,即含有三分支的平面和一个覆盖于其上的螺旋,并具有与受体结合时起灵活、定向作用的暴露的N端,这样的结构及N端对受体结合和信号转导是关键的,形成Eotaxin和大量存在于EOS上的CCR3高度选择性结合结构基础9,10。本实验显示IL-13刺激NHDF后,Eotaxin产生的浓度明显高于正常对照组。本组结果显示,不同浓度IL-13刺激NHDF24h后,IL-6、MCP-1和Eotaxin的蛋白表达水平显著升高,并呈剂量依赖关系。本研究初步表明

18、,IL-13在促进皮肤组织纤维化的病理过程可能通过IL-6(而非IL-8、MCP-1和Eotaxin等炎症因子的参与。参考文献1郭文昀,宋耀明,黄岚,等.脂联素对人脐静脉内皮细胞MCP-1和IL-8表达的影响.解放军医学杂志,2009,34:1344-1347.2钱革,李建国,吴剑波,等.辛伐他汀对体外培养系统性硬皮病患者的成纤维细胞增殖和胶原表达的影响.中国皮肤性病学杂志,2009,23:478-480.3Munitz A,Brandt EB,Mingler M,et al.Distinct roles for IL-13and IL-4via IL-13receptor alpha1and

19、 the type II IL-4receptor in asthma pathogenesis.Proc Natl Acad Sci,2008,105:724-725. 4Haseqawa M,Sato S,Naqaoka T,et al.Serum levels of tumornecrosis factor and interleukin-13are elevated in patients with localized scleroderma.Dermatology,2003,207:141-147. 5李晶冰,崔盘根.与系统性硬皮病相关的细胞因子.国外医学皮肤性病学分册,2005,31:235-237.6Kucharzik T,Lugering N,Pauels HG,et al.IL-4,IL-10andIL-13down-regulate monocyte-chemoattracting protein-1 (MCP-1production in activated intestinal epithelial cells.Clin Exp Immunol,1998,111:152-157.7Conroy DM,Williams TJ.Eotaxin and the attraction of eosinophilsto the asthmatic lung