乙酰肝素酶反义寡核苷酸对肺癌A549细胞侵袭力的抑制作用

1、乙酰肝素酶反义寡核苷酸对肺癌A?549细胞侵袭力的抑制作用    中国 作者：陈志涛 田辉 岳韦名 李林 亓磊 朱应超 【摘要】 目的 探讨乙酰肝素酶(heparanase，HPSE )反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)对人肺癌A?549细胞侵袭力的抑制作用。方法 想象合成互补于HPSE mRNA起始密码区的HPSE ASODN，以阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染人肺癌A?549细胞进行培养，采用流式细胞分析技术和逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)方法检测肺癌A?549细胞HPSE蛋白及其

2、mRNA表达的变化;以Matrigel细胞侵袭实验对HPSE AS?ODN对肺癌A?549细胞侵袭的抑制进行检测。结果 ASODN各组与正常对照组和脂质体组比较及ASODN各组间比较HPSE mRNA和蛋白的表达及细胞侵袭力均受到明显抑制 (P<0.01);ASODN在终浓度为100、200、400 nmol/L时对肺癌A?549细胞侵袭力的抑制率分别为55.6%、82.3%和91.2%。结论 HPSE ASODN通过下调HPSE mRNA和蛋白的表达可显著抑制肺癌A?549细胞的侵袭力，并呈剂量依赖性。 【关键词】 肺肿瘤;乙酰肝素酶; 反义寡核苷酸【Abstract】 Objecti

3、ve To evaluate the inhibitory effect of HPSE antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) on the invasiveness of human lung cancer A?549 cell lines.Methods HPSE ASODN which was complementary with initiation codon region of HPSE mRNA was designed and synthesized.After embedded by cation lipofectin，it was t

4、ransfected into A?549 cells of human lung cancer.The expression of HPSE protEin and HPSE mRNA in A?549 cell lines were detected by flow cytometry and RT? PCR.Meanwhile Matrigel invasive assay was used to measure the inhibitory effect of HPSE ASODN on the invasiveness of human A?549 cell lines.Result

5、s The HPSE protEIn and HPSE mRNA expression and invasiveness of human A?549 cells treated with ASODN of different concentrations were significantly decreased as the ASODN concentration increasing.There was a significant difference between control group and each group of ASODN respectively(P<0.01)

6、，between lipofectin group and each group of ASODN respectively(P<0.01)，and among the groups of ASODN (P<0.01).Besides，the difference of inhibitory effect was significant among the cells treated with different ASODN concentrations (P<0.01).The inhibition rates of A?549 cell invasiveness were

7、 55.6%，82.3 % and 91.2% treated by ASODN at final concentration of 100，200 and 400 nmol/L respectively.Conclusions By down?regulating the expression of HPSE mRNA and HPSE protein，HPSE ASODN has significant inhibitory effect on the invasiveness of human A?549 cell line in a dose?dependent manner.【Key

8、 words】 Lung neoplasm;Heparanase;Antisense oligodeoxynucleotide 侵袭和转移是肺癌的重要特征，是导致肺癌病人死亡的主要因素。乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是迄今为止发现的唯一能够降解细胞外基质和基底膜中的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)的酶，对于肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要作用1。本研究采用反义寡核苷酸(ASODN)技术转染人肺癌A?549细胞，用逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)和流式细胞学方法检测A?549细胞HPSE mRNA和蛋白表达，同时采用基质凝胶侵袭实验对转染细胞的侵袭力进行检测，以

9、初步探讨HPSE ASODN对A?549细胞的影响。 1 材料与方法 1.1 细胞培养 人肺癌细胞株A?549购自中科院上海细胞所，所有培养工作均在无菌环境下进行，培养于含有10%小牛血清的RPMI1640中，实验所用细胞均处于对数增长期。1.2 反义寡脱氧核苷酸的想象、合成 根据HPSE基因序列(GenBank accession number：AF155510)。想象互补于HPSE mRNA起始密码区(AUG及其下游17个核苷酸序列)ASODN序列：ASODN 5?GGCTTCGAGCGCAGCAGCA1?3，在GenBank中行Blastn证明ASODN仅与HPSE基因相应位点匹配。以上

10、寡核苷酸序列由上海生工生物工程公司合成、纯化，并行硫代磷酸化修饰，同时以荧光素FITC标记末端碱基。1.3 实验分组 实验设正常对照组(转染时不加脂质体，不加寡核苷酸)、脂质体对照组(转染时仅加脂质体，不加核苷酸)、ASODN组(转染时加脂质体和100、200、400 nmol/L ASODN)。根据预实验结果，各实验组在以上3种终浓度时转染率较高且不同浓度间无显著差别，故选择此浓度梯度进行实验。1.4 寡核苷酸的转染 采用阳离子脂质体Lipofectin(Invitrogen公司)转染。将细胞接种于6孔板，置于37、5% CO2孵育箱培养至约70%覆盖率。去除培养基，以温热无血清RPMI16

11、40漂洗细胞2次。将寡核苷酸分别溶于100 l无血清RPMI1640，另取10 l Lipofectin溶于90 l预暖的无血清RPMI1640，分置室温30 min后将两者轻柔混合，室温孵育15 min，以800 l无血清RPMI1640稀释Lipofectin?ODN复合体后轻铺于细胞上，不加抗生素，37、5%CO2孵箱孵育6 h。培养过程中设复孔常规以台盼蓝染色法检测细胞死亡率，各组细胞死亡率均5%。1.5 RT?PCR测定HPSE mRNA的表达 取转染后连续培养48 h的肺癌A549细胞，以TRIzol试剂(Gibco公司)提取总RNA，以紫外分光光度计测定RNA纯度并定量，在1%甲

12、醛变性凝胶上电泳验证RNA完整性。RT?PCR采用一步法试剂盒(KaTaRa公司)按厂家推荐步骤进行，扩增体系为50 l。本实验以 ?actin作为对照，对模板用量标准化。HPSE和?actin分两管进行扩增。引物序列参照 文献 1想象，由上海生工生物工程公司合成。HPSE(585 bp)上游5?TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC?3;下游5?GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC?3;?actin(250 bp)上游5?CAGAGCAAGAGAGGCATCC1?3，下游5?GGATAGCACAGCCTGGATAG?3，RT?PCR条件：50逆转录30 min，95预变性

13、5 min，94变性1 min，55退火1 min，72延伸1 min，30个循环后，72充分延伸10 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，PCR产物电泳结束后，紫外灯下观察照相并用Gel 1D凝胶图像分析系统分析测定其光密度，各电泳条带净密度值按下列公式 计算 ：净密度值=条带平均密度×面积(Pix),以HPSE条带净密度与?actin条带净密度的比值表示HPSE mRNA相对表达量进行半定量比较。1.6 HPSE的流式细胞学检查 取单细胞悬液1×106/ml，加入兔抗人HPSE单克隆抗体工作液100 l(购自武汉博士德公司)，室温孵育30 min，加入PBS10

14、 ml洗涤1次，弃上清，加入羊抗兔FITC IgG二抗工作液100 l，避光室温孵育30 min，加入PBS 10 ml离心同上，弃上清以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS 0.1 ml经500目铜网过滤后上机检测。设HPSE一抗的本底对照和阴性对照。采用美国Beckman Coulter公司消费的Epics?XLII型流式细胞仪，激发光源为15 mW氩离子激光器，激发波长为488 nm，应用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析，用多循环AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。检测前以flow?checkTMFluorpheres(10 m)荧光微球(REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA 92835)作为标准样品调整仪器CV值在2%以内。以荧光指数表示HPSE蛋白的相对含量。1.7 基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力 采用BD公司24孔基质凝胶侵袭小室，上下室间滤膜孔径为8 m，滤膜的上室面覆有细胞外基质凝胶，可模拟体内的细胞外基质和基底膜环境。取转染后连续培养24 h的A549细胞，以无血清RPMI1640制成2×105个/ml单细胞悬液，取200 l移入上室内，下室内加入500 l含有10%小牛血清的RPMI1640，置于37