丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路介导的p53基因抑制口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭的实验研究

1、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶通路介导的p53基因抑制口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭的实验研究    摘要 目的 探讨人重组p53腺病毒（rAd-p53）注射液抑制口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭的分子机制。方法 采用rAd-p53注射液转染人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113，观察p53基因过表达对该细胞系增殖及侵袭能力的影响，并用蛋白免疫印迹的方法检测Ad-p53转染前后Tca8113细胞系内丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路相关蛋白，细胞周期及凋亡调控蛋白细胞周期素D1（Cyclin D1）、P21、Bcl-2的表达。结果 Ad-p

2、53转染后显著抑制Tca8113细胞系增殖和侵袭（P<0.01），并促进细胞凋亡（P<0.001）。蛋白免疫印迹结果显示，rAd-p53转染后显著提高了Tca8113细胞P53和P21蛋白的表达，同时显著下调了Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达及AKT蛋白的磷酸化（P<0.01）。结论 AKT信号通路可能是p53引起的口腔鳞癌细胞增殖和侵袭抑制的关键分子机制，Cyclin D1、 P21和Bcl-2蛋白可能是AKT信号通路的下游调控基因，AKT信号通路及下游调控基因有望成为肿瘤基因治疗靶点。 关键词 口腔鳞状细胞癌； 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路； 细胞增殖； 侵袭

3、中图分类号 Q 257 文献标志码 A doi 10.7518/hxkq.2013.02.008 口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，常规手术治疗、放疗、化疗会给患者造成生理和心理上的巨大损害1。转基因治疗是指将外源性基 因导入体细胞以纠正遗传或获得性基因缺陷导致的疾病，目前被认为是最具潜力的治疗肿瘤的新手段。近年来研究表明：抑癌基因p53的突变或失活与多种肿瘤发生发展密切相关，并可能与某些肿瘤转移及患者预后有关2。人重组p53腺病毒（recombinant ade-novirus-p53，rAd-p53）是针对p53表达异常的新兴肿瘤基因治疗制剂，本研究用腺病毒载体将p53基因导入鳞

4、状细胞癌Tca8113细胞，观察其对Tca8113细胞增殖及侵袭行为的影响，并检测了相关信号通路、细胞周期及凋亡相关蛋白的表达情况。 1 材料和方法 1.1 材料 Tca8113细胞系来自上海交通大学附属第九人民医院馈赠，rAd-p53、带有绿色荧光蛋白标记的腺病毒（recombinant adenovirus-green fluorescent protein，rAd-GFP）注射液（规格为每支1×1012 vp，深圳赛百诺公司），CCK-8细胞毒性检测试剂盒（同仁化学研究所，日本），Transwell细胞侵袭试剂盒、ECL发光底物（密理博公司，美国），兔抗人P53、丝氨酸/苏氨酸

5、蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT）/磷酸化丝 氨酸/苏氨酸蛋白激酶（phosphor-serine/threonine ki- nase，pAKT）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular re-gulated protein kinases，ERK）/磷酸化细胞外调节蛋白激酶（phosphor-extracellular regulated protein ki- nases，pERK）、P38/pP38、c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）/磷酸化c-jun氨基末端激酶（phosphor-c-jun N-t

6、erminal kinase，pJNK）、细胞周期素D1（Cyclin D1）、P21、Bcl-2和GAPDH抗体及鼠抗兔二抗（Santa Cruz公司，美国），细胞周期检测试 剂盒、蛋白提取试剂盒（南京凯基生物有限公司）。 1.2 方法 1.2.1 细胞的培养和分组 Tca8113细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中贴壁生长，于37 、5%CO2的培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化传代。根据所加试剂不同分为3组。1）空白对照组：所加试剂为培养液；2）rAd-GFP组：所加试剂为rAd-GFP病毒液；3）rAd-p53组：加入rAd-p53病毒液。 1.2.2 腺病毒转染率（

7、multiplicity of infection，MOI） 的确定 将Tca8113细胞接种至96孔板中，接种细胞密度为每孔3×104个。rAd-GFP、rAd-p53分别按50、100、200、500、1 000病毒颗粒/细胞进行转染，每组3个复孔。轻轻混匀使病毒与细胞充分接触，然后把培养板放入37 、5%CO2的培养箱中培养。在转染的最初1 h内，每隔15 min轻轻摇动培养板1次。48 h后，在倒置荧光显微镜下每孔分别随机选择3个200倍视野计数呈现绿色荧光的绿色荧光蛋白（green fluo- rescent protein，GFP）阳性细胞数，在可见光下计数该视野内的总细

8、胞数，根据公式计算转染率，转染率=GFP阳性细胞数/该视野内总细胞数×100%。 1.2.3 细胞增殖实验 取对数期生长良好的细胞，以密度为每孔1×104个接种于96孔板，置于37 、5%CO2培养箱中连续培养5 d，在每天同一时间，每孔加入10 L CCK-8溶液，于培养箱中静置2 h，将96孔板放入酶标仪读取每孔光密度值（A值），每组设3复 孔，计算每孔平均值和标准差，绘制细胞生长曲线。 1.2.4 细胞侵袭实验 将细胞用0.25%胰酶消化重悬在无血清RPMI-1640培养基中，在Transwell侵袭小室的上室加入3×105/500 L个细胞，下室加入500

9、 L含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 、5%CO2培养箱中培养2 d，用棉签小心拭去上室表面未穿膜的细胞，将小室置于0.1%结晶紫中染色20 min，PBS洗去多余的染料，倒置显微镜下进行观察，每个小室随机选取10个视野计数穿膜的细胞数。 1.2.5 蛋白免疫印迹试验 检测P53、AKT/pAKT、ERK/pERK、P38/pP38、JNK/pJNK、Cyclin D1、P21、Bcl-2蛋白表达，GAPDH作为内参照。具体方法及流程参考文献3。 1.2.6 流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况 常规0.25%胰酶消化分离细胞，制备单细胞悬液，每组取3×105个细胞，

10、PBS洗2遍，分别加入RNase酶及PI/Annexin V染料，上机检测细胞周期和凋亡情况。 1.3 统计学分析 采用SPSS 15.0软件对实验结果进行分析，实验数据以mean±SD表示，组间数据比较采用student t检验，=0.05为显著性检验水准。 2 结果 2.1 Tca8113细胞的转染率 转染rAd-GFP、rAd-p53后，第2天可在倒置荧光显微镜下观察到荧光，以后荧光逐渐加强，5 d达到最强，随后减弱（图1）。500病毒颗粒/细胞的转染复数可使细胞转染率达到近100%。以500病毒颗粒/细胞的转染复数转染细胞，转染5 d后，收集细胞备用。 2.2 rAd-p53

11、转染抑制Tca8113细胞增殖 空白对照组、rAd-GFP组和rAd-p53组Tca8113细胞的增殖情况见表1。通过比较各组Tca8113细胞的增殖情况发现，rAd-p53组细胞的生长相对于空白对照组和rAd-GFP组明显被抑制（P<0.01）（表1）。 2.3 rAd-p53转染对Tca8113细胞侵袭能力的影响 Transwell细胞侵袭实验显示，rAd-p53组Tca8113细胞穿膜细胞数显著减少，与其他两组相比，差异有统计学意义（P<0.01）（图2）。 2.4 rAd-p53转染后Tca8113细胞丝裂原活化蛋白激 酶信号通路蛋白的表达 蛋白印迹定量分析结果显示，与其他

12、两组相比，rAd-p53腺病毒载体转染后显著提高了Tca8113细胞P53及P21蛋白的表达，同时显著下调了Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表达及AKT蛋白的磷酸化，差异有统计学意义（P<0.01）（表2，图3）。 2.5 rAd-p53转染对Tca8113细胞周期及凋亡情况的 影响 通过比较空白对照组、rAd-GFP组和rAd-p53组流式细胞术结果后发现，rAd-p53组细胞G2 /M+S期细胞百分率显著下降，与空白对照组和rAd-GFP组相比较差异有统计学意义（P<0.05）。此外，反映细胞凋亡指数的rAd-p53组细胞亚G1期细胞百分率显著高于空白对照组和rAd-GFP

13、组，差异有统计学意义（P<0.001）（图4，表3）。 1：空白对照组；2：rAd-GFP组；3：rAd-p53组。 3 讨论 P53蛋白主要分布于细胞核，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。野生型P53蛋白起分子警察作用，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。如有损伤，P53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，P53蛋白则引发细胞凋亡；如果p53基因的2个拷贝都发生了突变，对细胞的增殖失去控制，导致细胞癌变4。超过50%的 人类肿瘤中均存在p53基因的异常（包括点突变、等位基因缺失、重排、插入、基因融合等）

14、5。本研究通过外源导入野生型p53，发现口腔鳞癌细胞系Tca8113生长和侵袭能力显著下降，并且癌细胞凋亡显著增加，随后通过蛋白免疫印迹方法检测了丝裂原活化蛋白激酶信号通路、细胞周期及凋亡调控相关蛋白的表达，证实了P53蛋白通过调控AKT信号通路中AKT蛋白磷酸化、Cyclin D1、P21及Bcl-2蛋白的表达发挥抑制肿瘤生长和侵袭的作用。 组成性活化的AKT信号通路在广泛的人类肿瘤中失调，如卵巢癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、子宫内膜癌、成神经管细胞瘤、鼻咽癌、骨髓增生异常综合征等。其主要是由于PIK3CA基因编码的磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，

15、PI3K）扩增和（或）其他多种因素导致的AKT的过度活化6。Rea-gan-Shaw等7研究表明：利用RNAi降低乳腺癌细胞 中PI3K的表达后，FoxO转录因子活化增强，消除了AKT通路对FoxO转录因子介导的细胞生长停滞和细胞凋亡的抑制，促进癌细胞的凋亡。研究还发现：在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中，FoxO转录因子的活化能够抑制CDK4、CDK6、Cyclin D1的蛋白水平，导致细胞周期阻滞在G1期。此外，肿瘤细胞的迁移和黏附在肿瘤侵袭转移中起着重要的作用。在乳腺癌和卵巢癌中，AKT的过表达使IV型胶原蛋白上调整合素1，从而增加细胞的侵袭和转移8。而在鳞癌细胞系中AKT的持续性表达能诱导

16、上皮间质转变，赋予了组织侵袭和转移所需的运动性，表明AKT通路参与了黏附因子所介导的细胞黏附、运动和侵袭作用。AKT信号还能促进肿瘤坏死因子诱导的内皮细胞迁移，调节肿瘤血管的生成9。通过对成 纤维细胞采用逆转录病毒外源导入p53基因的方式发现，AKT信号通路能通过磷酸化P53结合鼠双微体同源基因2（mouse double minute 2，MDM2）蛋白影响P53的活性，磷酸化的MDM2转位到细胞核与P53结合，增加P53蛋白的降解，影响细胞存活，并且证实p53基因可能是通过下游WNT16基因调控了AKT信号通路的活化10。本研究通过对Tca8113细胞导入外源p53证实AKT蛋白显著磷酸化

17、，Cyclin D1和Bcl-2基因显著下调，p21基因显著上调，提示p53基因保护基因组完整性及抑制细胞增殖可能是通过AKT信号通路及其下游调控基因来发挥作用。 肿瘤与细胞周期调控失常有着密切联系。Cyclin D1是与许多肿瘤发生关系极为密切的原癌基因，其表达升高可激活CDK4和CDK6，并缩短G1期，造成细胞周期调节失控和细胞异常增殖。在甲状腺肿瘤和乳腺癌等多种肿瘤中均发现Cyclin D1基因扩增和 蛋白的过表达11。约有35%64%的头颈部鳞状细胞癌表现有Cyclin D1蛋白过度表达和（或）CCND1扩 增。首次手术标本中的Cyclin D1蛋白过度表达不仅与复发有关，还与病变演进

18、、淋巴结受累以及生存期缩短相关。最近还发现Cyclin D1蛋白在头颈部鳞癌手术切除标本中过度表达是独立的预后因素12。p21WAF1/ Cip1是最先发现的CKI基因，其作用主要是调控细胞周期蛋白依赖性激酶家族（cyclin-dependent ki- nases，CDKs）的活性，并参与由p53介导的细胞DNA损伤反应。当细胞损伤时，p53启动p21WAF1/ Cip1的表达，使其抑制Cyclin E-CDK2活性，导致视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）基因磷酸化水平降低，细胞停滞于G1期13。Bcl-2基因是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，Bcl-2的过度表达能增强

19、所观察细胞对大多数细胞毒因素的抵抗性。本研究通过对舌鳞癌细胞导入外源性p53基因后，发现细胞周期调控蛋白Cyclin D1和凋亡相关蛋白Bcl-2的表达显著降低，细胞周期调控蛋白P21表达显著提高，提示Cy-clin D1、P21和Bcl-2蛋白有可能是AKT信号通路的下游调控基因，有可能作为独立的预后因素参与口腔鳞癌患者的预后评价。 本文证实AKT信号通路对于细胞的增殖和凋亡的调节发挥了重要作用，并且发现Cyclin D1、P21和Bcl-2蛋白有可能是AKT信号通路的下游调控基因，AKT信号通路及下游调控基因有望成为新的肿瘤基因治疗靶点，并为治疗恶性肿瘤提供新的策略。 参考文献 1 Yu

20、T， Wang XY， Gong RG， et al. The expression profile of mi- croRNAs in a model of 7，12-dimethyl-benzaanthrance-induced oral carcinogenesis in Syrian hamsterJ. J Exp Clin Cancer Res， 2009， 28：64. 2 徐波， 张松涛， 李龙江， 等. 重组腺病毒p53转染口腔黏膜异常增 生细胞的实验研究J. 华西口腔医学杂志， 2009， 27（2）：122-125. Xu Bo， Zhang Songtao， Li Lon

21、gjiang， et al. An experimental study on recombinant adenovirus p53 transfected in oral dysplastic epi- thelial cellsJ. West China J Stomatol， 2009， 27（2）：122-125. 3 段勇， 黄韬， 袁育林， 等. 蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上 皮钙粘蛋白的表达J. 检验医学， 2009， 24（1）：52-56. Duan Yong， Huang Tao， Yuan Yulin， et al. Detection of E-cadherin e

22、xpressions in lung cancer tissues by western blot analysisJ. La- boratory Medicine， 2009， 24（1）：52-56. 4 Alkhalaf M， El-Mowafy AM. Overexpression of wild-type p53 gene renders MCF-7 breast cancer cells more sensitive to the antipro- liferative effect of progesteroneJ. J Endocrinol， 2003， 179（1）：55-

23、62. 5 Theoret MR， Cohen CJ， Nahvi AV， et al. Relationship of p53 over- expression on cancers and recognition by anti-p53 T cell receptor- transduced T cellsJ. Hum Gene Ther， 2008， 19（11）：1219-1232. 6 Hartmann W， Digon-S?ntgerath B， Koch A， et al. Phosphatidylino- sitol 3-kinase/AKT signaling is acti

24、vated in medulloblastoma cell proliferation and is associated with reduced expression of PTENJ. Clin Cancer Res， 2006， 12（10）：3019-3027. 7 Reagan-Shaw S， Ahmad N. RNA interference-mediated deple- tion of phosphoinositide 3-kinase activates forkhead box class O transcription factors and induces cell

25、cycle arrest and apoptosis in breast carcinoma cellsJ. Cancer Res， 2006， 66（2）：1062-1069. 8 Arboleda MJ， Lyons JF， Kabbinavar FF， et al. Overexpression of AKT2/protein kinase Bbeta leads to up-regulation of beta1 inte- grins， increased invasion， and metastasis of human breast and ova- rian cancer cellsJ. Cancer Res， 2003， 63（1）：196-206. 9 Grille SJ， Bellacosa A， Upson J， et al. The protein kinase Akt induces epithelial mesenchymal transition and promotes enhanced motility and invasiveness of squamous cell c