邻苯二甲酸二

1、邻苯二甲酸二         07-08-24 09:25:00     编辑：studa20         作者：宋晓峰，魏光辉，邓永继，张德迎，陈旋，刘星 【关键词】  二甲酸二    【Abstract】 AIM: To explore the mRNA expression of INSL3 gene in Leydig cells of feta

2、l and neonatal mice exposed to di(2ethylhexyl)phthalate (DEHP) in vivo and in vitro. METHODS：The Leydig cells were isolated from fetal mouse testis and were cultured in DMEM/F12 medium and identified by 3 betahydroxysteroid dehydrogenase (3HSD). Reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR)

3、 and in situ hybridization were used to examine the expression levels of INSL3 mRNA in primarily cultured Leydig cells incubated with DEHP (at the dose of 50，100，200 mg/L, respectively). Pregnant mice were exposed to DEHP at the dose of 100， 200 or 500 mg/kg body weight per day by gavage from gestat

4、ion day (GD) 12 to postnatal day （PND） 3. The expression of INSL3 gene in neonatal mouse testis was investigated by RTPCR. RESULTS: Histological alterations of primarily cultured Leydig cells and neonatal mouse testis exposed to DEHP were observed. The expression level of INSL3 mRNA in DEHP treated

5、groups including the primarily cultured Leydig cells and male mouse offsprings testis were lower than those of the control groups. CONCLUSION: DEHP can downregulate the expression level of INSL3 mRNA in Leydig cells in vitro and in vivo. It may be a possible mechanism that DEHP interferes with guber

6、naculum development and causes cryptorchidism.    【Keywords】 Di(2ethylhexyl), phthalate；fetus；Leydig cell；in situ hybridization ；RTPCR    【摘要】 目的：通过体内体外实验探讨邻苯二甲酸二（2乙基）己酯(DEHP)对胚胎及新生小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA表达的影响. 方法：DEHP 50，100，200 mg/L分别作用于原代培养的小鼠胚胎Leydig细胞，应用RTPCR和原位分子杂交

7、技术检测DEHP对Leydig细胞INSL3 mRNA表达的影响；DEHP分别以低、中、高三组剂量（100，200和500 mg/kgd）灌胃作用于GD（Gestation day）12PND（Postnatal day）3孕鼠，RTPCR检测新生小鼠睾丸INSL3 mRNA表达的相对强度. 结果：DEHP改变原代培养的小鼠胚胎Leydig细胞和新生小鼠睾丸的形态结构；各实验组包括原代Leydig细胞及不同时间点的新生鼠睾丸INSL3 mRNA表达水平、表达相对强度均明显低于对照组(P<0.05,或P<0.01). 结论：DEHP下调小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA的表

8、达,可能是影响引带发育导致隐睾的机制之一.    【关键词】 2乙基己基,邻苯二甲酸；胚胎；Leydig细胞；原位分子杂交；逆转录聚合酶链反应       0引言    邻苯二甲酸二（2乙基）己酯（DEHP），是塑料工业中广泛使用的增塑剂，是邻苯二甲酸酯类化合物（PAE）中的一种，也是公认的环境内分泌干扰物，可影响机体内分泌的活性. 研究发现邻苯二甲酸酯类化合物与先天性疾病如隐睾、尿道下裂等的发病具有明显的相关性1-3. 我们拟通过体内体外实验研究DEHP对胚胎及新生小鼠睾丸

9、Leydig细胞胰岛素样因子3(INSL3) mRNA表达的影响，探讨其与隐睾发病的相关分子机制.    1材料和方法    1.1材料昆明小鼠由重庆医科大学动物中心提供,合格证号为SYXK（渝）20040001. 孕期计算以成年雌雄小鼠合笼后，雌鼠见阴栓为受孕0 d. DMEM/F12(Hyclone公司),胎牛血清（天津TBD公司），DEHP（上海化学试剂有限公司），玉米油（美国Sigma公司），Trizol（Gibco公司），TaqDNA聚合酶、MMLV逆转录酶、dNTP(Promega公司)，原位杂交试剂盒（博士德公司），引物

10、：INSL3，actin引物序列应用软件Primer自行设计，由上海生工生物公司合成.    1.2方法    统计学处理： 数据用x±s表示，采用SPSS 12.0统计软件，多组间均数比较采用方差分析，两两比较采用LSDt检验,P<0.05为差异有统计学意义.    2结果    2.1原代培养的Leydig细胞纯度、形态学改变GD16胎鼠睾丸组织消化后的细胞悬液台盼蓝染色显示细胞存活率为(80.88±2.80). 培养前、培养72 h后细胞经3H

11、SD染色鉴定，Leydig细胞纯度分别为(45.10±1.66)（n=10），(81.17±2.32)（n=10）. 光镜下贴壁Leydig细胞透明，基本无颗粒，细胞轮廓清楚，增殖的细胞呈纤维细胞样生长，相互连接成单层膜状，34 d完全汇合. 细胞爬片HE染色及吖啶橙染色荧光显微镜下观察，Leydig细胞核呈圆形或卵圆形，嗜碱性，大多位于细胞中央,核仁12个，一般位于核的边缘部,其胞质轮廓为多角形，一般有34个突起. 加入一定浓度DEHP并作用相当时间后细胞增殖速度变慢，细胞轮廓变明显，细胞质粗糙，内有颗粒堆积，并出现空泡. 严重者细胞增殖停止，贴壁细胞脱落，上浮，崩溃溶解

12、.    2.2新生小鼠睾丸组织学改变光镜下，对照组PND 5小鼠生精小管呈实心的索状（性索），PND15小鼠部分生精小管开始管腔化，生精细胞层次少，层次清楚，约34层，细胞结构正常. 睾丸间质分布于生精小管之间，比较疏松,Leydig细胞数量少，散在分布. Leydig细胞大，核圆形或椭圆形，位于细胞中央（图1A）. DEHP各剂量组小鼠睾丸均出现明显的病理性改变：生精细胞程度不等的变性，细胞核边界不清楚，核形状不规则；Leydig细胞数量增多，以中、高剂量组PND 15小鼠睾丸为甚，Leydig细胞变性，细胞核不规则，胞质及部分胞核内见大小不一的空泡，细胞常聚

13、集成团，或排列成较大的细胞簇（图1B，C）.    2.3原代Leydig细胞INSL3 mRNA的表达溶剂对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；DEHP 50 mg/L组平均A值比对照组低（0.106±0.011 vs 0.122±0.013, 0.120±0.010, P<0.05）；DEHP 100和200 mg/L组与对照组、DEHP 50 mg/L组比较，A值降低（0.078±0.008, 0.072±0.008 vs 0.122±0.013, 0.120

14、7;0.010, 0.106±0.011, P<0.01).       2.4原代Leydig细胞及新生小鼠睾丸INSL3 mRNA的表达相对强度溶剂对照组与空白对照组差异无统计学意义（0.958±0.084 vs 0.982±0.063, P>0.05）；各实验组(DEHP 50, 100和200 mg/L组)INSL3 mRNA表达相对强度比对照组降低（0.820±0.050, 0.756±0.078, 0.702±0.052 vs 0.958±0

15、.084, 0.982±0.063, P<0.05或P<0.01）；DEHP 50 mg/L与DEHP 200 mg/L组两两比较差异有统计学意义（0.820±0.050 vs 0.702±0.052, P<0.05）. 提示：在体外，DEHP抑制Leydig细胞INSL3 mRNA的表达，且效应与剂量有关.    如表1所示，DEHP处理各组的INSL3 mRNA的表达相对强度在雄性仔鼠出生早期（PND 5）与对照组比较，即明显降低（P<0.01），实验组组间两两比较也有差异（P<0.01）；在PND15时，DEHP处理各组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05或P