食品中苯并(a)芘的测定

1、食品安全国家标准食品中苯并（a）芘的测定xxxx-xx-xx实施xxxx-xx-xx发布中华人民共和国卫生部 发布中华人民共和国卫生部 发布1.1.1.1 2010-06-01实施2010-××-××发布 前 言本标准代替GB/T 5009.27-2003食品中苯并（a）芘的测定及GB/T 22509-2008动植物油脂 苯并（a）芘的测定 反相高效液相色谱法。本标准与GB/T 5009.27-2003相比，主要变化如下：对原标准的结构进行了修改，增加了第三法，即GB/T 22509-2008；增加了安全防护方面的内容；增加了标准溶液的贮存期限；更改了试

2、样的名称；修改了层析柱的尺寸，并与第三法一致。明确了第一法与第二法的最低检出浓度；本标准与GB/T 22509-2008相比，主要变化如下：对原标准的结构进行了修改，增加了第一法与第二法，即GB/T 5009.27-2003；修改了配制标准贮备溶液的溶剂，使其与第一法一致；明确了配制标准曲线溶液的方法；规定了玻璃小瓶需要配有聚四氟乙烯内衬的密封盖子；色谱参考条件中增加了常规的C18反相色谱柱；修改了分析结果的计算公式。食品安全国家标准食品中苯并（a）芘的测定1 范围本标准规定了食品中苯并（a）芘的测定方法。本标准第一法与第二法适用于食品中苯并（a）芘的测定，第三法适用于动植物油脂中苯并（a）芘

3、的测定；第一法与第二法属于仪器分析法，适于精确测定，第二法属于目视荧光法，适用于没有荧光分光光度计的实验室进行概略定量。第一法 荧光分光光度法2 原理试样中苯并（a）芘经有机溶剂提取，或皂化后提取，提取液经液液分配或柱层析净化，然后在乙酰化滤纸上分离，因苯并（a）芘在紫外光照射下呈蓝紫色荧光斑点，将分离后有苯并（a）芘的滤纸部分剪下，用溶剂浸出后，用荧光分光光度计检测荧光强度，通过与标准比较进行定量。3 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 苯（C6H6）：重蒸馏。3.1.2 环己烷（C6H12或石油醚，沸程30 60 ）

4、：重蒸馏。3.1.3 二甲基甲酰胺（C3H7NO）或二甲基亚砜（C2H6OS）。3.1.4 无水乙醇（C2H6O）：重蒸馏。3.1.5 乙醇：体积分数为95%。3.1.6 无水硫酸钠（Na2SO4）。3.1.7 氢氧化钾（KOH）。3.1.8 丙酮（C3H6O）：重蒸馏。3.2 试剂配制3.2.1 展开剂：乙醇+二氯甲烷=2+1（体积分数）。3.2.2 层析用硅镁型吸附剂（又称弗罗里硅土，60目100目）：将硅镁型吸附剂经水洗四次（每次用水量为吸附剂质量的4倍）于垂融漏斗上抽滤干后，再以等量的甲醇洗（甲醇与吸附剂量克数相等），抽滤干后，吸附剂铺于干净瓷盘上，在130 烘箱中干燥5 h后，装瓶贮

5、存于干燥器内，临用前加5%的水减活，混匀并平衡4 h以上，最好放置过夜。3.2.3 层析用氧化铝（中性，100目200目）：120活化4h，储藏于干燥器内备用。3.2.4 乙酰化滤纸：将中速层析用滤纸裁成20 cm×4 cm的条状，逐条放入盛有乙酰化混合液的500 mL烧杯中，使滤纸充分地接触溶液，保持溶液温度在21 以上，时时搅拌，反应6 h，再放置过夜。取出滤纸条，在通风橱内吹干，再放入无水乙醇中浸泡4 h，取出后放在垫有滤纸的干净白瓷盘上，在室温下风干压平，盖上白瓷盘盖备用，一次可处理滤纸15条18条。3.3 苯并（a）芘标准品（C20H12）：CAS编号：50-32-8，纯度

6、不低于99.0%。警告苯并（a）芘是一种已知的致癌物质，测定时应特别注意安全防护。测定应在通风柜中进行并戴乳胶手套，尽量减少暴露。如已污染了皮肤，可以用10次氯酸钠水溶液浸泡和洗刷。这是由于次氯酸钠在水中能够释放新生态氧，其具有强烈的氧化性，可以破坏苯并(a)芘，经反复洗净的皮肤可以在紫外光下观察皮肤上有无蓝紫色斑点，直洗到蓝色斑点消失为止。3.4 苯并（a）芘标准溶液配制3.4.1 苯并（a）芘贮备液（100 g /mL）：精密称取10.0 mg苯并（a）芘，用苯溶解后移入100 mL棕色容量瓶中，并稀释至刻度。4 避光保存，至少6个月内稳定。3.4.2 苯并（a）芘工作液（1 g /mL）

7、：吸取1.00 ml苯并（a）芘贮备液置于100 ml容量瓶中，用苯稀释至刻度，4 避光保存，可保存1个月。3.4.3 苯并（a）芘标准工作液（0.1 g /mL）：吸取1 mL苯并（a）芘标准工作溶液（1 g /mL）置于10 mL容量瓶中，用苯稀释至刻度，4 避光保存，临用前配制。4 仪器和设备4.1 索氏提取器：容量为250 mL。4.2 玻璃层析柱（参见附录A）：配有烧结玻璃垫和聚四氟乙烯旋塞。4.3 层析缸：200×100 mm。4.4 旋转蒸发仪：配有带0.5 ml尾管的浓缩瓶。4.5 紫外光灯：带有波长为365 nm或254 nm的滤光片。4.6 回流皂化装置：锥形瓶磨

8、口处连接冷凝管。4.7 组织捣碎机。4.8 荧光分光光度计。5 分析步骤5.1 试样提取5.1.1 稻谷、小麦等粮食称取40.0 g60.0 g粉碎过的试样，装入滤纸筒内，用70 mL环己烷润湿试样，接收瓶内装6 g8 g氢氧化钾、100 mL乙醇及60 mL80 mL环己烷，然后将索氏提取器接好，于90 水浴上回流提取6 h8 h，将皂化液趁热倒入500 mL分液漏斗中，并将滤纸筒中的环己烷也从支管中倒入分液漏斗，用50 mL乙醇分两次洗接收瓶，将洗液合并于分液漏斗。加入100 mL水，振摇提取3 min，静置分层（约需20 min），下层液放入第二分液漏斗，往其中加入70 mL环己烷再振摇

9、提取一次，待分层后弃去下层液，将环己烷层合并于第一分液漏斗中，并用6 mL8 mL环己烷淋洗第二分液漏斗，洗液合并。用水洗涤合并后的环己烷提取液三次，每次100 mL，三次水洗液合并于原来的第二分液漏斗中，用环己烷提取两次，每次30 mL，振摇0.5 min，分层后弃去水层液，收集环己烷液并入第一分液漏斗中，于50 60 水浴上，减压浓缩至40 mL，加适量无水硫酸钠脱水。5.1.2 脂肪、油和乳化脂肪制品称取20.0 g25.0 g试样，用100 mL环己烷分次洗入250 mL分液漏斗中，以环己烷饱和过的二甲基甲酰胺提取三次，每次40 mL，振摇1 min，合并二甲基甲酰胺提取液，用40 m

10、L经二甲基甲酰胺饱和过的环己烷提取一次，弃去环己烷液层。二甲基甲酰胺提取液合并于预先装有240 mL硫酸钠溶液（20 g/L）的500 mL分液漏斗中，混匀，静置数分钟后，用环己烷提取两次，每次100 mL，振摇3 min，环己烷提取液合并于第一个500 mL分液漏斗。也可用二甲基亚砜代替二甲基甲酰胺。用40 50 温水洗涤环己烷提取液两次，每次100 mL，振摇0.5 min，分层后弃去水层液，收集环己烷层，于50 60 水浴上减压浓缩至40 mL，加适量无水硫酸钠脱水。5.1.3 熏烤肉类及熏烤水产品等肉、鱼及其制品称取50.0 g60.0 g切碎混匀的试样，再用无水硫酸钠搅拌（试样与无水

11、硫酸钠的比例为1:1或1:2，如水分过多则需在60 左右先将试样烘干），装入滤纸筒内，然后将索氏提取器接好，加入100 mL环己烷于90 水浴上回流提取6 h8 h，然后将提取液倒入250 mL分液漏斗中，再用6 mL8 mL环己烷淋洗滤纸筒，洗液合并于250 mL分液漏斗中，以下按5.1.2自以“环己烷饱和过的二甲基甲酰胺提取三次”依法操作。5.1.4 蔬菜称取100.0 g洗净、晾干的可食部分的蔬菜，切碎放入组织捣碎机内，加150 mL丙酮，捣碎2 min。在小漏斗上加少许脱脂棉过滤，滤液移入500 mL分液漏斗中，残渣用50 mL丙酮分数次洗涤，洗液与滤液合并，加100 mL水和100

12、mL环己烷，振摇提取2 min，静置分层，环己烷层转入另一500 mL分液漏斗中，水层再用100 mL环己烷分两次提取，环己烷提取液合并于第一个分液漏斗中，再用250 mL水，分两次振摇、洗涤，收集环己烷于50 60 水浴上减压浓缩至25 mL，加适量无水硫酸钠脱水。5.1.5 饮料如饮料中含二氧化碳，先在温水浴上加温除去。吸取50.0 mL100.0 mL试样于500 mL分液漏斗中，加2 g氯化钠溶解，加50 mL环己烷振摇1 min，静置分层，水层分于第二个分液漏斗中，再用50 mL环己烷提取一次，合并环己烷提取液，每次用100 mL水振摇、洗涤两次，收集环己烷于50 60 水浴上减压浓

13、缩至25 mL，加适量无水硫酸钠脱水。5.1.6 糕点类称取50.0 g60.0 g磨碎试样，装于滤纸筒内，以下按5.1.1自“用70 mL环己烷湿润试样”起依法操作。在5.1.1、5.1.35.1.6各项操作中，均可用石油醚代替环己烷，但需将石油醚提取液蒸发至近干，残渣用25 mL环己烷溶解。5.2 净化于玻璃层析柱下端填入少许玻璃棉，先装入5 cm6 cm高的氧化铝，轻轻敲管壁使氧化铝层填实、无空隙，顶面平齐，再同样装入5 cm6 cm高的硅镁型吸附剂，上面再装入5 cm6 cm高的无水硫酸钠，用30 mL环己烷淋洗装好的层析柱，待环己烷液面流下至无水硫酸钠层时关闭活塞。将试样环己烷提取液

14、倒入层析柱中，打开活塞，调节流速为1 mL/min，必要时可用适当方法加压，待环己烷液面下降至无水硫酸钠层时，用30 mL苯洗脱，此时应在紫外光灯下观察，以蓝紫色荧光物质完全从氧化铝层洗下为止，如30 mL苯不足时，可适当增加苯量。收集苯液于带尾管的浓缩瓶中，在50 60 水浴上减压浓缩至0.1 mL0.5 mL（可根据试样中苯并（a）芘含量而定，应注意不可蒸干）。5.3 分离5.3.1 展开：在乙酰化滤纸条上的一端2 cm处，用铅笔划一横线为起始线，吸取一定量净化后的浓缩液，点于滤纸条上，用电吹风从纸条背面吹冷风，使溶剂挥散，同时点20 L苯并（a）芘的标准工作液（1 g /mL），点样斑点

15、的直径不超过3 mm。层析缸内盛有展开剂，把滤纸条下端浸入展开剂约1 cm，盖住盖板，待溶剂前沿扩散至约20 cm时取出，用铅笔记下前沿位置，阴干。展开后比移值Rf应在0.1以下为好，否则分离程度差。5.3.2 溶解：在365 nm或254 nm紫外光灯下观察展开后的滤纸条，用铅笔划出标准苯并（a）芘及与其同一位置的试样的蓝紫色斑点，剪下此斑点分别放入小比色管中，各加4mL苯加盖，插入50 60 水浴中不时振摇，浸泡15 min。5.4 测定将试样及标准斑点的苯浸出液移入荧光分光光度计的石英杯中，以365 nm为激发光波长，在365 nm460 nm波长范围进行荧光扫描，所得荧光光谱与标准苯并

16、（a）芘的荧光光谱比较定性。在试样分析的同时做试剂空白，包括处理试样所用的全部试剂同样操作，分别读取试样、标准及试剂空白于波长406 nm、411nm、401nm处的荧光强度，按基线法由式（1）计算所得的数值，为定量计算的荧光强度。 （1）6 分析结果的表述试样中苯并（a）芘含量按公式（2）计算：（2）式中：X 试样中苯并（a）芘的含量，单位为微克每千克（g/kg）；S苯并（a）芘标准斑点的质量，单位为微克（g）；F标准的斑点浸出液荧光强度，单位为毫米（mm）；F1试样斑点浸出液荧光强度，单位为毫米（mm）；F2试剂空白浸出液荧光强度，单位为毫米（mm）；V1试样浓缩液体积，单位为毫升（mL）

17、；V2点样体积，单位为毫升（mL）；m试样质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留23位有效数字（或小数点后1位）。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20 %。8 其他本方法最低检出浓度为0.1 g/kg。第二法 目测比色法9 原理试样经提取、净化后于乙酰化滤纸上层析分离苯并（a）芘，分离出的苯并（a）芘斑点，在波长365 nm的紫外灯下观察，与标准斑点进行目测比色概略定量。10 试剂同3.13.4。11 仪器同4.14.8。12 分析步骤12.1 试样提取按5.1的方法操作。12.2 净化按5.2的方法操作

18、。12.3 测定吸取5、10、15、20或50 L试样浓缩液（可根据试样中苯并（a）芘含量而定）及10、20 L苯并（a）芘标准使用液（0.1 g /mL），点于同一条乙酰化滤纸上，按展开，取出阴干。于暗室紫外灯下目测比较，找出相当于标准斑点荧光强度的试样浓缩液体积，如试样含量太高，可稀释后再重点，尽量使试样浓度在两个标准斑点之间。13 结果计算试样中苯并（a）芘的含量按式（3）进行计算：（3）式中：X 试样中苯并（a）芘的含量，单位为微克每千克（g/kg）；m2 试样斑点相当苯并（a）芘的质量，单位为微克（g）；V1 试样浓缩总体积，单位为毫升（mL）。V2 点样体积，单位为毫升（mL）；m

19、1 试样质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留23位有效数字（或小数点后1位）。14 其他本方法最低检出浓度为1 g/kg。第三法 反相高效液相色谱法15 原理样品经溶剂溶解，通过氧化铝柱吸附，用洗脱试剂洗脱苯并（a）芘，用反相高效液相色谱分离，荧光检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。16 试剂和材料除特殊要求外，所用试剂为分析纯试剂，水为GB/T 6682规定的一级水。当使用推荐试剂以外的分析纯试剂时，应全部进行空白试验并报告空白分析的结果。16.1 试剂16.1.1 石油醚（沸程3060）或正己烷（C6H12）：每升加4 g氢氧化

20、钾颗粒重蒸。16.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。16.1.3 四氢呋喃（C4H8O）：色谱纯。16.1.4 其他同3.1。16.2 试剂配制16.2.1 乙腈四氢呋喃混合溶液：90 mL乙腈与10 mL四氢呋喃的混和溶液。16.2.2 层析用氧化铝（中性，100目200目）：Brockmann活度级（参见附录B），由活度为级的中性氧化铝减活制备而成。将90 g经450 灼烧12 h的氧化铝放入密闭容器中降至室温，加入10 mL水。剧烈摇动容器15 min，静置平衡24 h，室温下密闭避光保存。由于不同品牌氧化铝活性存在差异，建议对质控样品进行测试，使氧化铝活性满足苯并（a）芘的回收率要求

21、。建议应做相应的样品回收实验验证氧化铝活性。16.3 标准品同3.3。16.4 标准溶液配制16.4.1 苯并（a）芘中间液（100 ng/mL、10 ng/mL）：吸取1.0 mL苯并（a）芘标准工作溶液（3.4.2）置于1 0 mL容量瓶中，用乙腈四氢呋喃混合溶液稀释至刻度，混匀，得到浓度为100 ng/mL的苯并（a）芘中间液。相同方法把此工作液再稀释10倍，得到浓度为10 ng/mL的工作液，4 避光保存，临用前配制。16.4.2 标准曲线工作液：分别吸取10 ng/mL标准中间液0.4 ml、0.8 ml、4.0 ml于1 0 mL容量瓶中，吸取100 ng/mL标准中间液2.0 m

22、l、4.0 ml于1 0 mL容量瓶中，用乙腈四氢呋喃混合溶液稀释至刻度，混匀，该标准系列浓度分别为0.4 ng/mL、0.8 ng/mL、4 ng/mL、20ng/mL、40ng/mL，临用前配制。17 仪器和设备17.1 高效液相色谱仪，带有荧光检测器。17.2 玻璃小瓶：约1-2 mL，盖子内衬有聚四氟乙烯。17.3 其他同4.14.8。18 分析步骤18.1 样品的净化用玻璃烧杯称取约0.4 g试样，精确到1 mg，用2 mL石油醚溶液稀释。向层析柱中加入一半高度的石油醚。快速称取22 g氧化铝（16.2.2）于小烧杯中，立即转移到层析柱中，轻轻敲打层析柱，使氧化铝均匀沉淀。再装入一层

23、约30 mm高的无水硫酸钠。打开层析柱底部的旋塞，石油醚流出至无水硫酸钠的顶部，关闭旋塞。在层析柱出口端放置一个20 mL的量筒。向层析柱中移入样品溶液，用2 mL石油醚清洗层析柱内壁。向层析柱加入80 mL石油醚洗脱，流速为1 mL/min，洗脱液放满20 mL量筒后，弃去。换用圆底烧瓶收集其余洗脱液。将收集的洗脱液在65 的水浴中旋转蒸发至0.5 mL1.0 mL，转移至一个预先称量的玻璃小瓶中。玻璃小瓶置于35 的水浴中继续蒸发，并用氮气吹至近干（氮气流量大约为25 mL/min）。用石油醚清洗圆底烧瓶两次，每次1 mL，将清洗液转移至玻璃样品中，继续在35 及氮气条件下蒸发至干。称量玻

24、璃小瓶的质量（精确到0.1 mg），计算瓶内残渣的质量，旋紧瓶盖，4 储存备用。在18.2各项操作中，均可用正己烷代替石油醚。18.2 仪器参考条件色谱柱：多环芳烃专用色谱柱或C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；流动相：乙腈+水=880+120（体积比）；流速：1.0 mL/min；荧光检测器：发射波长406 nm（狭缝10 nm），激发波长384 nm（狭缝10 nm）。进样量：10 µL；18.3 标准曲线的制作将标准系列工作液依次按上述推荐色谱条件上机测定，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，色谱图参见附录C。

25、18.4 试样溶液的测定向装有待测试样的玻璃小瓶中注入0.1 mL的乙腈四氢呋喃混合溶液，涡旋溶解残渣（保证试样液溶解的残渣不能超过1.5 mg，若超过1.5 mg，需用四氢呋喃稀释或重新进行净化）。将10 µL的试样液注入液相色谱仪进行测定。使用标准曲线，对苯并（a）芘含量在0.1 µg/kg10 µg/kg的样品进行定量，苯并（a）芘含量在10 µg/kg50 µg/kg的样品应该稀释后进样或减少进样体积。19 分析结果的表述试样中苯并（a）芘含量按公式（4）计算： （4）式中：X 试样中苯并（a）芘的含量，单位为微克每千克（g/kg）；c

26、 从标准工作曲线得到的待测液中苯并（a）芘的浓度，单位为纳克每微升（ng/mL）；V 待测液体积，单位为微升（mL）；m样品质量，单位为克（g）。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留23位有效数字（或小数点后1位）。20 精密度本标准的精密度数据是根据GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的置信区间以95%来计算。20.1 重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过重复性限r，动植物油脂中苯并（a）芘的含量范围及重复性方程见表1。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。20.2 再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过再现性限R，动植物油脂中苯并（a）芘的含量范围及再现性方程见表1。表1重复性限和再现性限方程油脂类别含量范围（µg/kg）重复性限r再现性限R植物油0.550.0r = 0.0843 m+0.313R= 0.10