应用cDNA-AFLP研究甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育 差异表达基

1、应用cDNA-AFLP研究甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育 差异表达基因吴建勇，沈俊儒，刘平武，杨光圣（华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，武汉 430070）摘要：【目的】显性细胞核雄性不育（DGMS）是油菜杂种优势利用的重要途径。为了更好地理解该不育系统的分子机理，对甘蓝型油菜显性核不育的育性相关基因进行初步的研究。【方法】利用cDNA-AFLP对显性核不育材料两用系Rs1046AB的不育株和可育株进行了对比分析。【结果】共得到32个差异片段，分别属于27个uniGene，其中在可育株中增强或特异表达的有26个，不育株中只有1个。17个可以在NCBI数据库中找到同源序列（包括EST），10

2、个没有找到同源序列。对17个已知序列的分析表明，这些片段参与了代谢、转录、细胞周期、蛋白质修饰、细胞间运输、信号转导和花发育等相关过程。此外，Northern印迹分析结果表明检测片段的表达模式与PAGE胶结果一致。【结论】本研究为更深入的研究甘蓝型油菜显性核不育的育性相关基因提供了基础，并对雄配子的发育研究也具有一定参考价值。关键词：甘蓝型油菜；显性细胞核雄性不育；cDNA-AFLP；雄配子发育Differentially Distinguished Expressed Genes in Dominant Genic Male Sterility (DGMS) Brassica napus U

3、sing cDNA-AFLP WU Jian-yong, SHEN Jun-ru, LIU Ping-wu, YANG Guang-sheng(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)Abstract: 【Objective】 Dominant genic male sterility (DGMS) is an important way to utilize the heterosis of Brassica napus. So, p

4、ilot studies were conducted for better understanding the mechanism of the DGMS. 【Method】 By using cDNA-AFLP, the fertile plants and sterile plants between the homozygous DGMS two-type line Rs1046AB were studied. 【Result】There were 32 differentially expressed bands between them which belonged to 27 u

5、niGene. Among them, 26 bands were only expressed or expressed in a higher level in fertile plants, and only 1 band in sterile plants. 17 bands could find homologous sequence, but the other 10 bands were maybe some novel genes. The 17 homologous sequences participated in the following biological proc

6、ess: metabolism, transcription, cell cycle, protein fate, signal transduction mechanism, cellular transport and flower development etc. Furthermore Northern blot demonstrates that it was consistent with the result of PAGE. 【Conclusion】This research could give basic information about the dominant gen

7、ic male sterility in Brassica napus and male gametogenesis.Key words: Brassica napus; Dominant genic male sterility; cDNA-AFLP; Male gametogenesis0 引言【本研究的重要意义】显性细胞核雄性不育（DGMS）是油菜杂种优势利用的重要途径，其突出优点是败育彻底，并能实现三系配套，可以产生100%的不育系群体，种子生产时不必拔掉50%的可育株。而如果能对该不育系统的分子机理进行研究，将为更好的利用这一材料打下基础。【前人研究进展】李树 林13、董振生4等通过

8、多年研究揭示了显性核不育的遗传规律，并在此基础上建立了以纯合两型系、临保系和恢复系三系配套的制种模式5。周熙荣等6利用该模式选育了显性核不育双低油菜杂交新品种核杂3号。陆光远等7找到了与不育基因紧密连锁的标记。从研究技术上来看，cDNA-AFLP是Bachem等8以AFLP为基础发明的RNA指纹分析技术。其特点是重复性好，假阳性率低；而且该技术不需要预先了解研究材料的序列信息，有利于发现新基因；此外该方法只需较少的起始材料（100200 mg左右）。因此该技术广泛应用于分子生物学研究的各个领域：（1）构建转录连锁图，如Brugmans等9构建了拟南芥和马铃薯表达基因的转录连锁图；（2）基因表达

9、特征的研究，如Dit等10研究了植物对根瘤土壤杆菌感染的反应；（3）分离特异表达基因，如吴才君等11分析了杂种与亲本莲座期叶片的基因差异表达类型与构成主要生物学产量性状的杂种优势关系。【本研究切入点】虽然该不育系统已经得到一定的应用，但是，在实际应用中，寻找同源两型系和恢复系仍然是比较困难的工作。而且，到目前为止，对于显性核不育的分子机理目前了解的仍然很少。【拟解决的关键问题】本试验利用cDNA-AFLP研究甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育败育关键时期的花药，以期得到与育性相关的转录片段（TDF），从而了解近等基因系Rs1046AB之间的基因表达差异，对育性控制的分子机制进行初步探讨，为更好的利用

10、这一材料奠定基础。1 材料与方法1.1 材料与取材甘蓝型油菜显性核不育系Rs1046A（MsMsrfrf）及其表型正常的姊妹系Rs1046B（MsMsRfrf）由国家油菜改良武汉分中心（华中农业大学油菜研究室）提供，2003年10月2日种植在华中农业大学油菜试验地。2004年34月确定其育性后收获花粉母细胞时期花药，放入液氮中速冻，保存于-80冰箱中备用。1.2 cDNA-AFLP总RNA提取采用Qiagen RNeasy plant Mini Kit，按其说明书操作。双链cDNA合成采用LD-PCR的方法（Clontech SMARTTM cDNA Library Construction

11、Kit。AFLP参照Bachem等8,12方法，反应产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，显影步骤参照陆光远 等13的方法。1.3 差异片段的回收、克隆、测序和分析将目的差异片段直接从聚丙烯酰胺凝胶上用灭菌的刀片切下，放入离心管，加入50 µl ddH2O，充分捣碎，煮沸10 min，稍微离心，上清液即可作为再扩增反应的模板。扩增产物利用BBI EZ Spin Column PCR Product Purification Kit进行纯化。纯化产物用Promega pGEM-T Vector system 进行蓝白斑筛选，单克隆经验证后送上海生工测序。测序结果提交NCBI数据库（htt

12、p://BLAST）进行分析，分析结果根据MIPS A. thaliana Genome Database （http:/mips.gsf.de/proj/funcatDB/search_main_frame.html）进行功能归类。1.4 Northern杂交Northern杂交的转膜和杂交过程参照分子克隆实验指南（第三版）中的Southern印迹程序。探针标记采用TaKaRa Random Primer DNA Labeling Kit，65杂交1216 h，-80自显影1周左右。2 结果与分析2.1 cDNA的合成LD-PCR梯度试验结果表明当循环

13、数为21时，点样孔附近已经有明显的拖带，说明反应已经过了平台期，而循环数为18时，条带较亮，而且没有明显拖带，表明刚好到达平台期，因此本试验采用17个循环进行LD-PCR。2.2 AFLP分析本试验共用16对引物（256种引物组合）在可育材料和不育材料中进行了扩增，经过统计，每个泳道大约有20条带左右。最后筛选到23对有多态性的引物对，图1-A显示的是经过筛选后有多态性的引物对扩增所得到的部分结果。图1-B展示了试验中所获得的2种差异带型：有无差异和表达量差异。最终本实验得到32个能重复出现的差异片段，大约只占所有扩增片段的0.31%，说明这个近等基因系可育材料和不育材料间遗传背景很相似。2.

14、3 差异片段功能分析获得的差异片段经Blast分析表明它们属于27个uniGene，结果见表1。然后根据生物过程（biological process）和MIPS A. thaliana Genome Database对这些差异片段进行功能归类，结果见表2。从表2可以看到，27个片段共参与了28个生物学过程，但只有10个片段所参与的过程是已知的，包括代谢、转录、细胞周期、蛋白质修饰、细胞间运输、信号转导和花发育等，这些过程与雄配子的发育都有关系。其余17个（约60.7%）片段则是没有同源性或功能未知的，表明可能得到了与雄配子发育相关的新基因。2.4 Northern杂交分析A. AFLP扩增图

15、 B. 差异片段A. Amplification of AFLP B. Differential bandsA是使用经过筛选后的23对多态性引物扩增所得到的部分结果。B中箭头1标示有无差异的差异带，箭头2则标示表达量有差异的带型A was the partial result of amplification using the screened 23 polymorphic primers. In figure B, arrow 1 represented the differentially band that only was observed in Rs1046B, arrow 2 r

16、epresented the differentially band that was expressed in different levels in two materials 图1 AFLP扩增和差异片段Fig.1 Amplification of AFLP and differentially bands为了保证实验的可信性，对部分差异片段进行了Northern杂交分析，其中与花发育相关的片段以及不育株特异片段的Norhern印迹如图2。结果表明，花发育相关片段的Northern杂交结果与PAGE胶的结果一致；而不育材料中的特异片段，Northern杂交的结果和PAGE胶有所不同，其可

17、能原因是：该片段在PAGE胶上信号较弱，而银染法的检测灵敏度有限，因此PAGE胶上可育材料不能检测到该片段，但是Northern杂交的检测灵敏度要高许多，所以能在两材料中都检测到较弱的信号，不过仍然可以看出在不育材料中是上调表达的，因此Northern杂交结果与PAGE胶结果也是吻合的。这些表明本研究所得结果是可靠的，而且，cDNA-AFLP应用于油菜的基因差异表达分析是完全可行的。3 讨论目前研究差异表达基因的方法很多，与其它方法相比cDNA-AFLP具有以下突出优点：（1）重复性好，本试验中的差异片段可以稳定地重复出现，即使是不同年份取的材料也能扩增得到相同的差异片段；（2）假阳性率低，本

18、试验选取部分片段的Northern杂交表表1 Blast分析结果Table 1 Result of Blast 编号IDNCBI登录号Accession No.得分/E值Score/E序列信息Content10-11-1Z19120418/e-114A.thaliana mRNA for RNA polymerase II second largest subunit3-11-2AY376734113/2e-22Arabidopsis thaliana 4-coumarate CoA ligase isoform 10 mRNA,complete cds13-11NM_114696157/1e

19、-35Arabidopsis thaliana cysteine proteinase, putative (At3g48350) mRNA, complete cds5-16-1AL16150894/2e-16Arabidopsis thaliana DNA chromosome 4, contig fragment No. 204-3NM_12510296/3e-17Arabidopsis thaliana epsin N-terminal homology (ENTH) domain-containing protein3-3NM_100039161/1e-36Arabidopsis t

20、haliana fringe-related protein (At1g01570) mRNA, complete cds.6-9NP_18190196/2e-19lectin-related (Arabidopsis thaliana.)5-16-5NM_10552564/8e-08Arabidopsis thaliana oxidoreductase family protein (At1g68540) mRNA, complete cds.13-14-1NM_128304123/2e-25Arabidopsis thaliana rac GTPase activating protein

21、, putative (At2g27440) mRNA, complete cds12-4-2CD81300354/7e-05BN15.001D24F011204 BN15 Brassica napus cDNA clone BN15001D24, mRNA sequence13-14-2CD818704123/1e-25BN20.046G15F011220 BN20 Brassica napus cDNA clone BN20046G15, mRNA sequence14-7CD829365141/4e-31BN40.041O08F011207 BN40 Brassica napus cDN

22、A clone BN40041O08, mRNA sequence5-16-3AF458408222/2e-55Brassica oleracea glycine-rich protein (GRP1) mRNA, complete cds.5-16-4AY345237102/2e-21Brassica rapa MADS-box protein (AGL20) mRNA, complete cds.7-14-2CN54488064/9e-08EST0094 Apple developing fruit differentially expressed cDNA library Malus x

23、 domestica cDNA 5' similar to aspartate aminotransferase, mRNA sequence5-16-6S64617105/2e-20PCNA=proliferating cell nuclear antigen (Brassica napus=oilseed rape, cv. Westar, apical meristem, mRNA, 1004 nt).3-11-1CD84105290/4e-15RFO2.121K06F010608 RFO2 Brassica napus cDNA clone RFO2121K06, mRNA s

24、equence无同源性No homology10-1-2, 12-4-1, 13-14-5, 15-10, 2-6, 3-1-1, 4-11-1, 5-16-2, 7-14-1, 7-7表2 差异片段的生物过程归类Table 2 Classify the differential bands by biological process生物学过程Biological process数量Amount比例(%)PercentMetabolism27Cell cycle and DNA processing14Transcription14Protein fate (folding, modifica

25、tion, destination)27Cellular transport, transport facilitation and transport routes27Cellular communication/signal transduction Mechanism14Flower development14Protein with binding function or cofactor requirement 14Function unknown27EST51No homology1031 2 3A是片段5-16-4 （AGL20） Northern杂交的结果。B是不育株中特异表达

26、的片段5-16-6的Northern杂交图。图中左边的箭头指向PAGE胶上的差异带；右边箭头表示转到膜上的RNA的两条带：28S和18S。A was the result of Northern blot of band 5-16-4(AGL20). B was the result of the special band expressed in sterile plants. The arrow on the left side indicated the differential band on the PAGE; and the right one indicated the two

27、bands (28S and 18S) of total RNA transfered to nylon membrance1PAGE胶；2Northern杂交；3Total RNA转膜效果1. Figure of PAGE; 2. Result of Northern blot; 3. Total RNA transfered to nylon membrane图2 Northern杂交Fig.2 Result of Northern blot明结果与PAGE胶一致，说明该技术所获得的差异片段比较可靠，与DDRT-PCR近70%的假阳性率相比这是一个突出的优势；（3）cDNA-AFLP只需很

28、少的起始材料（只需200 mg左右），通过LD-PCR就可以得到足够的双链cDNA，这一点对于像本试验一样难以取到大量材料的情况来说显得尤为重要。但是在LD-PCR过程中，必须注意PCR反应平台期的因素，循环数过多会增加非特异性扩增的产物。256种引物组合扩增结果显示，每个泳道大约有20条带左右，这与以DNA为模板进行扩增能得到平均34.5条带14相比要少很多，李凌等15认为这主要是因为总DNA中含有内含子，而cDNA中没有内含子，只有表达基因。最终在2个材料间得到了32个重复性好的差异片段，其中31个在可育材料中增强或特异表达，只有1个在不育材料中增强表达。可能的原因有二：其一，在败育关键时

29、期，不育材料的雄配子发育过程就终止了，而可育材料雄配子继续正常发育，因此可育材料中检测到的大部分差异片段可能是下游表达的产物；其二，不育材料和可育材料前期的基因表达情况相似，不育材料中出现的差异带应该很少。油菜雄配子发育是一个复杂的过程，目前所获得的拟南芥雄性不育相关基因大部分是通过对突变体的研究和反向遗传学的方法而发现的16。雄配子发育过程涉及上万个基因，而且与这些基因严格的时空表达有关系，此外体内外因子对这种表达调控的也有很大影响，任何一个基因或体内外调控因子的变化或者异常都可能引起花药发育的不正常，从而导致雄性不 育17, 18。本试验所用的显性核不育材料Rs1046AB派生于宜3A，通

30、过杨光圣等19电镜观察发现，其败育关键时期为花粉母细胞时期，即这一时期后，不育材料的雄配子发育就不正常了，表现为雄配子发育相关基因的表达受到抑制或者根本就不表达，这也就是cDNA-AFLP能够检测到2种差异带型（有无的差异和表达量上的差异）的原因。这与王学德等20所研究的水稻雄性不育差异显示情况相似。但是，由于对雄配子发育的分子机制了解的仍然很少，特别是关于发育前期即四分体以前的时期17，其中涉及的大量基因仍然有待研究。本试验所获得的27个uniGene中有10个不能找到同源序列也说明了这个问题。对于17个能找到同源序列的差异片段，因为每个基因所涉及的功能较多，所以，本试验从其参与的biolo

31、gical process考虑，结果发现这些片段涉及代谢、转录、细胞周期、蛋白质修饰、细胞间运输、信号转导和花发育等相关过程。其中涉及花发育的相关基因为AGL20，这一基因在可育材料中增强表达（图2），而已有的报道表明，该基因参与了控制开花的redundant vernalization、autonomous和photoperiod 这3条主要的代谢途径21,22，而且这一基因的过量表达表明该基因不仅可以抑制迟开花基因FRI 和 FLC，而且对于植物从营养组织向生殖组织的转变同样起着重要的调节作用21。通过田间观察发现可育材料比不育材料开花确实有所提前，说明该基因对于控制开花时间所起的作用，但

32、是该基因是否对该材料育性产生影响还不好定论；有可能是营养组织向生殖组织转变过程中的微小差异引起后期雄配子发育的不正常。此外找到的其他差异片段所涉及的过程，如代谢、转录、细胞周期等都是植物雄配子发育过程所必须的，因此本试验为雄配子发育的研究提供了基础。虽然本试验可能不能得到直接与该材料育性相关的关键基因，但是所得到的片段可能是与雄配子发育相关的基因，而且所得到的差异片段是2种材料在花粉母细胞时期某一关键基因的表达不同而检测到的下游表达产物，所以通过了解这些差异片段共同的调控机制，有可能找到花粉母细胞时期与育性相关的关键基因。4 结论 本研究利用cDNA-AFLP技术对甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育

33、的差异表达基因进行了初步的研究。最终在可育材料和不育材料间得到了32个差异片段，通过Blast等分析，对这些片段所参与的生物学过程也进行了初步的研究。此外，通过Northern杂交对试验数据的可信性也进行了验证。因此，本研究为更深入的研究甘蓝型油菜显性核不育的育性相关基因提供了基础，而且对雄配子的发育研究也具有一定参考价值。References1 李树林, 钱玉秀, 吴志华. 甘蓝型油菜细胞核雄性不育的遗传规律探讨及其应用. 上海农业学报, 1985, 1(2): 1-12.Li S L, Qian Y X, Wu Z H. Inherit genetic sterility in Brass

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