第七章 蛋白质的分离、纯化和表征

1、第七章 蛋白质的分离、纯化和表征7.1 本章主要内容1）蛋白质的酸碱性质2）蛋白质分子的大小和形状3）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀4）蛋白质分离纯化方法7.2 教学目的和要求：通过本章学习，使学生掌握蛋白质的物理化学性质，在此基础上对现实生活中的现象给出合理的解释，同时为后续知识的学习打下基础。7.3 重点难点1.蛋白质分离纯化方法2.蛋白质物理化学性质及应用7.4 教学方法与手段 讲授与交流互动相结合，采用多媒体教学。7.5 授课内容一、 蛋白质的酸碱性质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸、碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要是侧链基团，及少数N端-NH2和C端-COOH。天然球状蛋白

2、质的可解离基团大部分可被滴定，而某些天然蛋白质中有一部分可解离基因由于埋藏在分子内部或参与氢键形成而不能解离。1.等电点和等离子点（中性盐Ca2+、Mg2+、cl、HPO42+）等电点：以兼性离子形式存在的蛋白质的pH 值。在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的比例有关。等离子点：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体解离出的质子数与质子受体结合的质子数相等时的pH值称等离子点，是每种蛋白质的特征常数。2.蛋白质的电泳分离3.离子交换层析分离蛋白质二、 蛋白质的大小与形状测分子量的方法：1.化学组成法2.凝胶过滤法3.SDS-

3、PAGE法4.沉降分析法5.渗透压法三、 胶体性质与蛋白质的沉淀蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋中，置水溶液中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋白质仍留在袋中。蛋白质在水中溶解度依赖于多肽链氨基酸残基侧链基团的相对极性，离子化基因数量越多，溶解度越大。1.稳定蛋白质胶体溶液的主要因素（1） 蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开，不会互相碰撞凝聚而沉淀。（2） 两性电解质非等电状态时，带同种电荷，互相排斥不致聚集而沉淀。一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从溶

4、液中析出沉淀。2.沉淀蛋白质的方法（1） 盐析法  ：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。（2） 有机溶剂沉淀法 ： 破坏水化膜，降低介电常数（3） 重金属盐沉淀pH大于等电点时，蛋白质带负电荷，可与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀（4） 生物碱试剂和某些酸类沉淀法pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，单宁酸、苦味酸、钨酸。酸 类：三氯乙酸、磺基水杨酸。（5）加热变性沉淀四、

5、 蛋白质的变性变性作用：理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失，溶解度下降，不对称性增大及其它理化常数改变。1.变性的因素：强酸和强碱； 有机溶剂； 去污剂；还原性试剂；盐；重金属离子；温度； 机械力等。2.变性的实质：次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。注意：变性不汲及一级结构的破坏。3.蛋白质变性后的变化： 结晶及生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。 硫水侧链基团外露。理化性质改变，溶解度降低、沉淀，粘度增加，分子伸展。 生理化学性质改变。分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。实际应用： A.消毒灭菌：75%乙醇，紫外线，高温。B.制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。4.变性机理热变性（往

6、往是不可逆的）多肽链受到过分的热振荡，引起氢链破坏。酸碱变性：破坏了盐链。有机溶剂：破坏水化膜，降低蛋白质溶液介电常数。五、 分离纯化蛋白质的主要方法分离纯化蛋白质的方法与原理1.溶解度差异：PEG沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法2.热稳定性差异：热处理沉淀法、铜锌SOD（65、15分钟、稳定）3.电荷性质差异：离子交换层析法、电泳法4.分子大小和形状差异：凝胶过滤、超滤法；透析法、离心法5.亲和力的差异：亲和层析法：某种蛋白质能与一种配基特异而非共价结合。配基是指能被生物大分子识别并与之结合的原子、原子团和分子，如酶的底物、辅酶、调节效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白、抗原与抗体。7.6 教学建议理论联系实际，让学生从日常生活中的现象出