重组人肝再生增强因子可逆转免疫损伤性肝纤维化

1、    重组人肝再生增强因子可逆转免疫损伤性肝纤维化        摘要目的：了解重组人肝再生增强因子(hALR)抗免疫损伤性肝纤维化的活性。方法：建立人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化模型。模型完成后予hALR 腹腔注射。观察肝纤维化大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)水平，肝组织胶原蛋白含量及肝脏病理学改变。结果：重组人肝再生增强因子(hALR)可降低肝纤维化大鼠的ALT、AST、LDH水平；肝组织胶原蛋白含量的测定表明hALR治疗

2、组大鼠肝组织胶原含量明显低于模型组及阴性对照组；病理组织切片也发现hALR治疗组大鼠肝纤维化程度较模型组及阴性对照组明显减轻。结论：重组人肝再生增强因子(hALR)可逆转免疫损伤性大鼠肝纤维化。主题词重组蛋白质类； 免疫刺激复合物； 肝疾病中分类号R322.4+7文献标识码A文章编号1000-4718(2000)04-0298-03 The reversal effects of recombinant human augmenter of liver regeneration in immunocomplex induced liver fibrosisWANG Ai-min， DU Shu

3、ang-cun， GUO Rui-feng, (252 Hospital of PLA, Baoding 071000, China)YANG Xiao-ming,WANG Qing-ming， HE Fu-chu(Academy of Militory Medical Science, Beijing 100850, China)Abstract AIM: To observe the anti-fibrosis activity of recombinant human augmenter of liver regeneration (hALR). METHODS: Albumin ind

4、uced rat model of liver fibrosis was established and hALR was given peritoneally after the model production. Serum concentration of alanine aminotransferase(ALT),aspartic aminotransferase(AST),lactate dehydrogenase(LDH), hepatic collagen contents and pathological examination were selected as observi

5、ng parameter. RESULTS: Recombinant human augmenter of liver regeneration (hALR) could decrease ALT, AST, LDH concentration of fibrotic rats. The measurements of hepatic collagen contents showed that hepatic collagen contents in hALR treatment group was much lower than those of model group and negati

6、ve control group. Pathological examination also indicated that the degree of liver fibrosis in hALR treatment group was attenuated in comparison with those of model group and negative control group. CONCLUSION: Recombinant human augmenter of liver regeneration (hALR) had reversal effects on immunoco

7、mplex induced rat liver fibrosis.MeSHRecombinant proteins; Immunostimulating complexes; Liver diseases肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration, ALR)是Hagiya等11994年从新生大鼠肝组织中克隆的一种理化性质与肝刺激物(hepatic stimulator substance,HSS)相似的促肝细胞增殖因子。新近，杨晓明等2克隆了大鼠ALR的人类同源分子。并通过构建原核表达载体，获高效表达菌株，进而获得重组hALR3。生物活性研究表明：重组hAL

8、R在体外实验中可提高CCl4诱导损伤肝细胞的存活率，降低受损细胞的LDH释放率。体内实验表明：重组hALR对急性肝损伤有良好的治疗作用4。我国是肝炎的高发区，慢性肝病的治疗一直是肝病界研究的热点。初步研究表明从哺乳动物幼仔肝、胚胎肝组织提取的HGF.HSS有抗慢性肝损伤的作用。本研究旨在以人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化为模型，观察重组人肝再生增强因子(recombinant human augmenter of liver regeneration,hALR）对已形成的肝纤维化的治疗作用。材料和方法一、 材料(一)动物Wistar大鼠120只，雌雄各半，体重180220 g，由中国医学科学院

9、动物中心提供。(二)人ALR自行构建的pBV-hALR表达菌株3 ，经诱导表达、纯化，获纯度95%的hALR。(三)其它实验材料人血白蛋白为卫生部兰州生物制品研究所产品。羟脯氨酸标准品为中国科学院中生公司产品。二、方法(一)模型的复制、动物分组及标本留取模型复制参照王宝恩等5的方法复制人血白蛋白免疫损伤性肝纤维化模型。用100只Wistar大鼠造模，完成后存活64只。动物分组：正常组20只；模型组20只；hALR治疗组22只：造模完成后腹腔注射hALR 50 g/kg，每日1次，共治疗2个月。阴性对照组22只：造模完成后每日腹腔注射等量生理盐水，时间同hALR治疗组。标本留取：各组动物在hAL

10、R治疗前(即造模后)、hALR治疗1月、hALR治疗2月时每次分别活杀6只。切取肝脏同一部位,除留病理检查外，余迅速投入液氮,此后转入70保存待检，血液样品离心后取血清送检。(二)肝组织胶原蛋白含量测定参照郑少雄等6的方法，略有改动，将所得结果羟脯氨酸含量换算为胶原蛋白含量。(三)血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、 天冬氨酸转氨酶(aspartic aminotransferase, AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)的测定：用意大利Biotechcnica instruments生产的BT3000TARG

11、A全自动生化分析仪测定。(四)统计处理数据以±s表示；各组、各观察点间行单因素方差分析处理。结果一、hALR对肝纤维化大鼠血清ALT、AST、LDH水平的影响(见表1)表1hALR对血清ALT、AST、LDH水平的影响Tab1Effects of hALR on the serum concentration of ALT, AST and LDH(U/L，±s,n=6)Pretreatment Treat 1 monthTreat 2 monthsALT42.3±5.745.3±3.639.9±5.1NormalAST138.7±1

12、6.4143.7±20.2146.5±11.8LDH896.3±101.3906.2±97.7920.3±136.9ALT82.3±10.663.5±7.838.6±4.3ModelAST320.1±29.6236.1±20.2143.1±12.0LDH1796.3±203.31386.3±107.2896.3±103.1Negative controlALT79.5±9.865.3±5.946.6±7.9AST298.7&#

13、177;30.1229.6±19.71136.1±15.8LDH1834.1±195.51307.5±99.1908.8±79.5ALT83.4±12.347.3±5.1*43.6±3.6hALRAST307.5±20.6139.6±12.8*140.3±11.5LDH1867.5±204.3967.1±81.1*936.1±77.8*P0.01,vs model and negative control group 由表1可见,治疗前模型组、阴性对照组、

14、hALR组血清ALT、AST、LDH水平无显著差异，明显高于正常组。治疗1个月时，模型组及阴性对照组血清ALT、AST、LDH水平较治疗前有所下降，而hALR治疗组血清ALT、AST、LDH水平下降更低，与模型组及阴性对照组相比有显著差异(P值均0.01)。治疗2个月时，各组血清ALT、AST、LDH均已降至与正常对照组水平间无显著差异。二、hALR对肝纤维化大鼠肝组织原蛋白含量的影响(见表2)表2hALR对各组大鼠肝组织胶原蛋白含量的影响Tab 2 Effects of hALR on hepatic collagen content (mg/g，±s)PretreatmentTr

15、eat 1 monthTreat 2 monthsNormal1.93±0.121.97±0.141.97±0.12Model6.45±0.175.93±0.125.35±0.17Negative control6.52±0.275.88±0.225.39±0.17hALR6.45±0.164.87±0.13*3.86±0.22*P0.01,vs model and negative control 由表2可见，治疗前模型组、阴性对照组、hALR组肝组织胶原蛋白含量无明显差异

16、，均数倍于正常对照组。治疗1个月、2个月时，模型组、阴性对照组肝组织胶原蛋白含量较治疗前逐渐下降，而hALR治疗组肝组织胶原蛋白含量下降更为明显，与模型组及阴性对照组相比有显著差异(P均0.01)。三、重组人肝再生增强因子(hALR)对肝纤维化大鼠肝组织病理变化的影响肝组织切片HE染色光镜下可见：治疗前模型组 、阴性对照组、hALR治疗组3组大鼠肝细胞广泛坏死，脂肪变性，有炎性细胞浸润；肝小叶结构破坏，纤维组织增生明显，将肝小叶分隔包绕成大小不等的肝细胞团。治疗1月、2月时hALR治疗组上述病理改变明显减轻，汇管区及小叶间纤维组织增生明显轻于治疗前；治疗2月时仅可见汇管区纤维组织向小叶间伸展，

17、未完全包裹肝小叶。模型组及阴性对照组在相对应的观察点虽也可见病理变化的减轻，但与hALR治疗组相比，上述病理改变仍甚明显。讨论人血白蛋白免疫损伤性大鼠肝纤维化的形成机制为抗原-抗体复合物在肝脏血管壁沉积，激活补体，引起中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润。释放溶酶体酶、肿瘤坏死因子、IL-1、PDGF等细胞因子，引起细胞损伤；损伤局部的微环境、单核-巨噬细胞激活后释放的细胞因子，均可成为肝脏星状细胞的激活剂。现知肝脏星状细胞是肝纤维化形成过程中最重要的细胞，它的活化是肝纤维化发生、发展的重要因素。临床上由慢性肝炎发展所形成的肝纤维化在发生机理上与大鼠免疫损伤性肝纤维化甚为相似。我们既往的研究表明

18、：重组人肝再生增强因子(hALR)可阻止四氯化碳中毒性大鼠肝纤维化的形成7。本文研究了hALR对已形成的免疫损伤性肝纤维化的治疗作用，结果表明：hALR可明显降低肝纤维化大鼠的血清ALT、AST、LDH水平；可明显降低肝纤维化大鼠的肝组织胶原蛋白含量；病理切片观察发现hALR治疗组大鼠汇管区及小叶间的纤维组织沉积较模型组及阴性对照组显著为轻。上述结果表明重组人肝再生增强因子对免疫损伤性肝纤维化有明显的逆转作用。重组人肝再生增强因子逆转免疫损伤性肝纤维化的机理目前尚不清楚。是抑制了胶原蛋白的合成？还是促进了胶原蛋白的降解？或兼而有之？对此我们正在进行研究。基于其逆转肝纤维化的活性，hALR可望成

19、为临床上慢性肝病的治疗药物。基金项目 国家863计划资助项目(863-102-08-05-1)；全军医学重点实验室科研基金资助王爱民（解放军252医院实验中心，河北 保定 071000）杜双存（解放军252医院实验中心，河北 保定 071000）杨晓明（军事医学科学院放射医学研究所， 北京 100850）郭瑞峰（解放军252医院实验中心，河北 保定 071000）王清明（军事医学科学院放射医学研究所， 北京 100850）贺福初（军事医学科学院放射医学研究所， 北京 100850）参考文献1Hagiya M ,Francavilla A , Polimence L , et al. Clonin