大鼠运动力竭后中性粒细胞粘弹性研究

1、    大鼠运动力竭后中性粒细胞粘弹性研究        摘要：本文将多形核中性粒细胞模拟为一各向同性的均质粘弹性球形固体。利用球谐函数法求解大鼠运动力竭前后中性粒细胞在小变形条件下的蠕变问题。理论计算所得的大鼠运动力竭前后中性粒细胞表面位移响应与微管吸吮实验结果吻合较好。本文结果显示大鼠运动力竭后中性粒细胞弹性模量K1、K2和粘性系数分别比运动前增加118%，59%和71%，提示力竭性运动对中性粒细胞粘弹性有明显影响。文章还对中性粒细胞蠕变问题的时效关系作了研究。关键词：多

2、形核中性粒细胞；粘弹性；力竭性运动；小变形分类号：R318.01; Q66; O345INVESTIGATION ON VISCOELASTICITY OFPOLYMORPHONUCLEAR NEUTROPHILS IN RATAFTER EXHAUSTIVE EXERCISEQin Tingwu（West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041）Yang Ruifang Jiang JiahuanCai ShaoxiWu Yunpeng （Chongqing University, Chongqing 400044）ABSTR

3、ACT：Solid spherical harmonic method was used to solve the creep of a rat polymorphonuclear neutrophil modeled as a isotropic and homogeneous spherical solid under small deformation. The calculated surface displacements before and after exhaustive exercise showed an excellent agreement with those obt

4、ained by the micropipet aspirating experiment technique. Compared with those of the controls (before exhaustive exercise), the viscoelastic coefficients K1， K2 and for rat PMNs after exhaustive exercise increased by 118%, 59% and 71%, respectively. These results showed that there was significant eff

5、ect of exhaustive exercise on viscoelastic properties of neutrophils in rat. The ageing alteration of viscoelastic parameters of rat PMNs also was studied in this paper.Key words：Polymorphonuclear neutrophils; Viscoelasticity; Exhaustive exercise; Small deformation0引言大量研究证明，过量的运动对机体免疫系统造成损伤，增加机体对感染的

6、易感性1。长时间剧烈运动会损害局部粘膜和机体免疫能力2。中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophils, PMNs)占整个人体外周血循环白细胞总数的5060%，它是人体最好的一种吞噬细胞。通常认为PMN是组成免疫系统内在功能部分，是机体防御外来感染媒质的第一道防线3。PMN功能的发挥与其流变特性密切相关4。对PMN粘弹性的研究，对于认识PMN与血管内皮细胞的相互作用，对于分析PMN的生理功能是非常重要的。PMN可被视为由一层膜包着的流变体。细胞的受力和变形对细胞的功能和结构有直接的影响。由于在细胞内部存在着极其复杂的细胞骨架系统，才使得细胞具有主动变形和抵抗被动变形的能

7、力。用连续介质力学研究PMN的力学行为，常把细胞视为各向同性的均质连续体。本文选择标准固体模型作为描述PMN粘弹性的理论模型。资料显示，运动力竭后血液生理生化环境发生变化5，PMN处于某种程度的激活态6。有关运动性疲劳后血液流变学改变已进行了研究7，但运动力竭后白细胞流变学特性的研究至今未见报道。本文旨在探讨大鼠力竭性运动后，PMN粘弹性的变化，从细胞流变学角度，揭示力竭运动所致的PMN粘弹性改变与其结构和功能改变的关系。这对于疲劳学说的研究不仅具有重要的理论意义，而且具有极重要的实用价值。1中性粒细胞粘弹性理论模型简述本文研究PMN在阶跃吸压作用下发生小的被动变形的粘弹性行为。设PMN是不可

8、压缩的均质粘弹性球形固体，半径为R。采用标准固体粘弹性模型8，如1所示。K1、K2为弹性模量，为粘性系数。采用符号记法，设ij为细胞内的应力分量，每个分量都是直角坐标(x,y,z)和时间t的函数，则应力偏量ij为ij=ij+Pij(1)式中ij为Kronecker算子，P为静水压，i,j=x,y,z。设细胞内点(x,y,z)处t时刻的位移为ui,则在小应变条件下，Eulerian应变(2)考虑不可压缩条件，相应的应变偏量eij为略去细胞重力和惯性力，应力平衡方程为(3)由1,细胞本构方程为9(4)由(1)(4)可得出描述PMN蠕变运动的Navier方程为(5)式中为蠕变函数，由(4)式经Lap

9、lace变换法可得(6)上式中令表示常应力作用下伸长(应变)的蠕变时间常数。在球坐标系(r,)下，用球谐函数法10，可求得细胞表面进入微吸管内的距离(见2)为(7)式中，为微吸管内半径。Ln()为n阶Legendre多项式，=cos,且满足sP()dS=0,S=SI+SG+SO为细胞表面,见2。对于给定的细胞、微吸管和吸压P,(7)式可表示为d(t)=J(t)F(R,P,rP,hP)(8)其中F=F(R,P,rP,hP)表示R，P，rp,hp的函数。hp为微吸管壁厚。将(6)式代入(8)式，得到位移d(t)与时间t的关系式(9)若吸压P为常数，则式(9)可进一步写为(10)上式中f(R,rp,

10、hp)为R，rp,hp的函数。当t=0时，由(10)式可得(11)(11)式表明，对于给定的细胞、微吸管和吸压，细胞的初始变形为一弹性响应，变形值与K1+K2成反比。因此，K1+K2越大，细胞初始变形越小，细胞刚性越大。当0<t<时，由(10)式可见，细胞发生的变形为蠕变过程。变形的快慢取决于蠕变时间，越大，细胞变形越缓慢。当t时，由式(10)可得(12)由(12)式可见，对给定的R,rp,hp,P,细胞发生的最大变形(在小变形条件下)与K1成反比。因此，K1越大，最大变形越小，细胞刚性越大。1中性粒细胞标准固体模型2变形的中性粒细胞2材料与方法2.1实验动物、分组与运动方法任意选

11、取16只纯系Wistar雄性大鼠，自由进食和饮水，鼠龄1416周，体重200300g。将大鼠随机分为2组，每组8只，分别为对照组(BEFORE)和运动力竭组(AFTER)。对照组为笼内正常生活状态，运动力竭组以在3337水中，鼠尾负2%体重，游泳至“经10s后仍不能返回水面”作为力竭状态的标准进行力竭性游泳运动。2.2中性粒细胞分离方法按文献11，用密度梯度离心法分别分离对照组和运动力竭组大鼠静脉血中性粒细胞，将PMN悬浮液制成所需的浓度(约每立方毫米50个细胞)。经台盼蓝检查，PMN活力大于95%；PMN纯度大于98%。2.3微管吸吮实验方法见文献12。微吸管内半径限制在1.01.5m之间，

12、实验温度37。微吸管实验在2h内完成。设d(t)是PMN细胞膜进入微吸管时变形的长度(测量值)，为了确定PMN粘弹性参数K1，K2，按最小二乘法原理，将理论模型计算结果(7)与实验结果d(t)进行拟合。2.4时效关系对大鼠PMN在缓冲液中的粘弹性参数随悬浮时间的变化进行了研究。悬浮时间分为4段：(1)分离后即刻到1h；(2)12h；(3)23h；(4)3h以上。分别计算各段内的粘弹性参数，并用符号等级检验法(Wilcoxon tests)对各个时段的粘弹性参数进行统计学处理。3实验结果及分析3.1实验结果大鼠PMN在阶跃吸压P(t)作用下，细胞表面进入微吸管内的距离d(t)随时间t的变化过程，

13、见3所示。从此可以看出，大鼠PMN对阶跃吸压的响应包括一个初始快速变形和继之发生的缓慢蠕变过程。3大鼠PMN对阶跃吸压响应的位移时间过程用标准固体模型拟合实验数据，得到的大鼠PMN粘弹性参数(±s)及统计结果见表1。大鼠运动前PMN粘弹性参数K1,K2和分别为12.3±5.4Pa,20.9±7.8Pa和6.6±4.6Pa.S;运动力竭后大鼠PMN粘弹性参数K1,K2和分别为26.8±6.0Pa,33.3±8.7Pa和11.3±4.9Pa.S,分别增加了118%，59%和71%。表1大鼠运动力竭前后PMN在缓冲液中粘弹性参数(

14、37)对照组(N=8,n=43)力竭组(N=8,n=43)显著性水平K1(Pa)12.3±5.426.8±6.0P<0.05K2(Pa)20.9±7.833.3±8.70P<0.05(Pa.S)6.6±4.611.3±4.9P<0.05N为大鼠数，n为细胞数 大鼠PMN在缓冲盐白蛋白溶液中粘弹性参数(±s)时效变化见表2。表2大鼠PMN在缓冲液中粘弹性参数的时效变化(37)(1)：01h(n=16)(2):12h(n=16)(3):23h(n=16)(4):>3h(n=16)K1(Pa)12.0

15、77;5.212.3±5.517.9±7.118.3±4.8K2(Pa)20.4±9.019.5±7.630.0±5.733.0±5.7(Pa.S)6.8±4.67.4±4.89.7±3.712.7±4.9从表2可见，大鼠PMN粘弹性参数随悬浮时间增加而增大。大鼠PMN粘弹性参数在各时段的统计结果见表3。 表3大鼠中性粒细胞粘弹性参数在不同时间段的统计结果(2)/(1)(3)/(1)(3)/(2)(4)/(1)(4)/(2)K1NSP<0.05P<0.05P<0.05

16、P<0.05K2NSP<0.05P<0.05P<0.05P<0.05NSNSNSP<0.05P<0.05NS为无统计学差异 从表3可以看出，大鼠PMN从分离即刻开始，K1和K2在2h内没有明显变化，超过2h，增加明显；在3h内无明显变化，3h以后明显增加。3.2分析讨论从实验结果看，大鼠运动力竭后PMN粘弹性发生变化，变形程度减小，刚性增大。由于吸吮实验中微吸管半径限制在1.01.5m范围内，在小变形条件下，吸入微吸管内的是PMN胞浆及膜的小部分，不涉及PMN的核，因此核对变形行为的影响可忽略；大鼠PMN膜表面有许多褶皱，当吸入长度小于微管半径时，PM

17、N膜对变形行为的影响很小。由此推测，小变形微吸管吸吮实验结果主要反映了PMN胞浆的流变学特性，尤其是PMN的细胞骨架网络结构13。从PMN胞浆生物化学研究可知，PMN的细胞质或胞浆占细胞体积的大部分，因此它是PMN流变特性的最重要的决定因素。其内含有单独的和聚合肌动蛋白14、肌球蛋白15和肌动结合蛋白16，在细胞质的聚合过程中它们发生相互作用17。肌动结合蛋白在等温条件下，能使肌动蛋白提取物从粘性溶液聚合成具有强力弹性成分的粘弹凝胶18。这种凝胶受到机械剪切，能表现出粘滞特性；剪切停止，它们自动恢复凝胶状态。在PMN胞浆中，还有一些蛋白质分子如凝溶蛋白和锥形蛋白可以影响肌动蛋白细丝的长度19。

18、在PMN中肌动蛋白和肌球蛋白比例高于肌细胞中。在非聚合状态，肌动蛋白不形成微丝，分子排列不形成纤维定向；在聚合状态，微丝形成，肌动蛋白分子进行了分子重排。PMN的流变学行为是其生物化学和分子组成的功能表现。研究PMN生物流变学和生物化学间的相互关系，有助于认识PMN生物学结构和其功能的关系。本文对大鼠运动力竭前后PMN粘弹性研究结果显示，运动力竭后大鼠PMN粘弹性参数明显增大，可能预示了运动力竭后大鼠PMN骨架蛋白的某种变化20。大鼠运动力竭后，由于PMN胞浆中微丝聚合，微管组装，使PMN处于一定程度的激活态，因而导致了PMN粘弹性参数增加。Chien等21研究发现，用秋水仙素处理人PMN以破

19、坏胞浆中微管的完整性，结果使PMN粘弹性参数(K2和)减小。Chien等22用细胞松驰素B破坏胞浆微丝，使微丝解聚，结果使PMN粘弹性参数K1，K2和都减小。这些研究结果表明微丝和微管在PMN流变学特性方面，起着重要作用。本文研究结果与上述结论基本一致。分离后的PMN在悬浮介质中会发生形态和结构的变化。本文关于大鼠PMN粘弹性参数时效研究表明，分离出的PMN在2h内，悬浮液对PMN粘弹性的影响没有明显差异，因而可以认为大鼠运动力竭后PMN粘弹性的改变是由力竭性运动引起的。进一步的研究工作是探讨力竭性运动引起PMN粘弹性改变的机制。基金项目：国家自然科学基金资助项目（39470282）作者单位：

20、秦廷武（华西医科大学附一院骨科，成都 610041）杨瑞芳（重庆大学生物工程研究院，重庆 400044）蒋稼欢（重庆大学生物工程研究院，重庆 400044）蔡绍皙（重庆大学生物工程研究院，重庆 400044）吴云鹏（重庆大学生物工程研究院，重庆 400044）参考文献：1Mackinnon LT, Tomasi TB. Immunology of exercise, Ann Sports Med 1986,3(1):142Douglas DJ, Hanson PG. Upper respiratory infections in the conditioned athlete. Med Sci

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