大黄虫丸经旁分泌途径对早期肝纤维化的干预作用

1、大黄虫丸经旁分泌途径对早期肝纤维化的干预作用         作者：成家茂，潘志恒，谢瑶，何宏文，曲怀刚 【摘要】 目的观察大黄虫丸经旁分泌途径对大鼠肝星状细胞增殖及其表达TGF-1 基因的影响。 方法采用Nycodenz 分离液非连续密度梯度离心法同步分离急性CCl4 损伤模型大鼠和正常大鼠肝的枯否细胞（KC）和星状细胞（HSC）。                &

2、#160;        作者：成家茂，潘志恒，谢瑶，何宏文，曲怀刚【摘要】【关键词】  大黄虫丸肝纤维化 肝星状细胞旁分泌Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Dahuang Zhechong Pill on the proliferation of rat hepatic stellate cells(HSCs) activated by paracrine pathway and the expression of transforming growth fa

3、ctor-beta 1(TGF-1) gene.MethodsThe CCl4-injured and normal rat Kupffer cells(KCs), hepatic stellate cells were separated by non-continuous density gradient centrifugation of Nycodenz medium. After the common rat and the drug sera prepared, they were added respectively into Kupffer cell culture plate

4、s for normal Kupffer cells conditioned medium(NKCCM) and injured rat Kupffer cells conditioned medium(KCCM) after 48 h. We observed the changes of proliferative HSCs by the methods of MTT and 3H-thymidine(3H-TdR) incorporation assay, and the expression of TGF-1 gene in HSCs by semi-quantitative RT-P

5、CR when HSCs were actived for 24 h by those conditioned medium.ResultsIn all paracrine groups, the multiplication of HSCs and the relative expression of TGF-1 gene were increased markedly compared to normal control group(P0.05 or P0.01), and gradually decreased in all drug and no drug serum groups w

6、ith elevated drug concentration.There had significant diferences among all groups.ConclusionDahuang Zhechong Pill can obviously inhibit the proliferation of rat HSCs activated by paracrine pathway and the expression of TGF-1 gene in HSCs and deerease hepatic fibrosis in  a concentration-depende

7、nt manner.Key words： Dahuang Zhechong Pill;   Liver fibrosis;   Hepatic stellate cell;  Paracrine     肝纤维化是从各型慢性肝病转化为肝硬化的一个重要病变过程，有效逆转肝纤维化已成为防治肝硬化的重要手段。它是一个伴随肝内细胞外基质（ECM）增多和沉积的瘢痕化过程，在细胞和分子水平上以HSC 的活化、转化生长因子1 （transforming growth factor-beta 1，TGF-1）及其下游细胞调节因子活

8、性异常为主要特征1。因此，抑制HSC活化和减少肝组织内TGF-1 的表达是逆转肝纤维化的中心环节。大黄虫丸（DHZCW）具有缓中补虚、活血化瘀、通络软坚等功效，以往的临床和实验研究表明该药在防治肝纤维化方面效果明显2，3。本实验拟观察大黄虫丸对CCl4 损伤大鼠肝组织内经旁分泌途径活化的星状细胞（HSC ）的增殖和TGF-1 基因表达情况的影响，进一步探讨该药抗肝纤维化的作用机制。1  材料与仪器1.1  动物雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，SPF 级，体质量400500 g，均由中山大学中山医学院实验动物中心提供，普通饲料和普通饮水饲养。实验前禁食12 h。

9、1.2  HSC 细胞株由北京大学人民医院肝胆外科中心魏玉华老师惠赠。1.3  药物大黄虫丸药粉为暗紫色粉末，由广东阳江制药厂惠赠。1.4  试剂和仪器链霉蛋白酶E（Pronase E）、型胶原酶（Type collagenase）、DNase I、胰蛋白酶（Trypsine）、Nycodenz 原液、噻唑蓝（MTT）均购自Sigma 公司；四氯化碳（CCl4）、高纯度琼脂糖、核酸染料等生化试剂购自上海生物工程有限公司；M199 培养液（标准型）、DMEM 干粉均购自Invitrogen 公司产品；标准胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自杭

10、州四季青生物制品公司；总RNA提取试剂（RNAiso Reagent）、RT-PCR试剂盒（TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0）及100 bp DNA Markers 均购自宝生物工程（大连）有限公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；氚-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）购自中国科学院上海原子核研究所等。OLYMPUS CX31 型倒置相差显微镜（OLYMPUS 公司）；Heraeus Biofuge 15R型台式高速冷冻离心机（德国Heraeus 公司）；Heraeus BB16 型CO2 恒温培养箱（德国Heraeus 公司）；SDJ-SP 三相单人水平层流洁

11、净工作台（上海淀山湖净化厂）；FJ - 211G 双道液体闪烁仪（西安二六二厂产品）；Bio-Tek EL×800型全自动酶标仪（美国Bio-Tek 公司产品）；POWER-PAC300 型电泳仪（美国BIO-RAD 公司产品）；MJ PTC-100TM 型PCR 仪（美国MJ Rearch 公司产品）； BIO-MATE 5 型紫外可见光分光光度计（BIO-MATE 日本公司生产）等。2 方法2.1  含药血清及正常鼠血清的制备参考文献方法4给予SD 大鼠灌胃服用大黄虫丸药粉（每只每天2.7 g）。将上述药粉用超纯水溶解，每天分两次灌胃给药，4 ml/次，连续给药5 d。

12、空白对照组为正常大鼠组，灌胃等量超纯水。采血时间为末次灌胃后1 h，以乙醚麻醉大鼠，无菌状态下打开大鼠心脏，经右心房抽血，2 000 r/min 离心15 min，血清经56灭活30 min 后置于-20冰箱内保存备用。2.2  造模采用SD 雄性大鼠，皮下注射50% CCl4 5 ml/kg （与植物油按11比例混合），5 d 后分离KC。2.3  KC 的分离参考文献5 并改进，分离培养损伤模型鼠和正常鼠的KC，台盼蓝染色法检测细胞活性，碳素墨汁吞噬实验鉴定细胞。正常大鼠的细胞得率为0.5×1071.0×107 /肝，损伤模型鼠的细胞得率为1.0&#

13、215;107 1.5×107/肝,纯度均90%。2.4  HSC 细胞株的培养以5×103 cells/cm2接种于50 ml 培养瓶内，加入含10% FBS 的M199 培养液，每3 天左右铺满单层后传代。2.5  条件培养液（CM）制备正常鼠KC 条件培养液（NKCCM）的制备：参考文献6 并改进。KC 以1×105 cells/cm2 密度接种于6 孔培养板，培养48 h 后吸弃培养液，再加入含20% 正常鼠血清的DMEM 培养液3 ml 继续培养，24 h 后收集上清液，0.22 m 微孔滤膜过滤，记为NKCCM。同样方法48 h 后

14、再收集1次，两次的NKCCM 混合，置于-70 冰箱中保存备用。损伤鼠KC 条件培养液（KCCM）的制备：方法同上，但加入的血清为药物血清，浓度分别为含0% （0% 药物血清+ 20% 正常鼠血清），5% （5% 药物血清+ 15% 正常鼠血清），10% （10% 药物血清+ 10% 正常鼠血清）和20% （20% 药物血清，无正常鼠血清），收集的上清液分别记为0%，5%，10%和20% KCCM。2.6  实验分组对照组：将HSC 细胞株接种于培养板培养24 h 后，弃去培养液，加入NKCCM，作用于HSC 24 h后即可检测。旁分泌组：包括0%，5%，10%，20% KCCM组共

15、4组。加入CM 方法同对照组。2.7  活化HSC 增殖的检测采用MTT 法和3H-TdR 掺入法检测。MTT 法：称取125 mg MTT放入小烧杯中，加25 ml PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）搅拌15 min，用0.22 m 的微孔滤器除菌，分装后4 避光保存备用。将铺满单层的HSC用0.25% 胰酶消化后，以103 cells /孔密度接种于96 孔板中。培养24 h 后，吸弃上清，分别加入NKCCM，0%，5%，10%，20% KCCM 各200 l（每组设3 个复孔，用不同批次的CM 重复实验3 次）。继续培养至20 h后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/m

16、1）20 l，孵育4 h弃上清液，PBS 洗涤，然后每孔加入200 l DMSO，小心振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择570 nm 波长，以酶标仪检测各孔OD 值。3H-TdR 掺入法：将HSC以104 cells /孔密度接种于24 孔板中，培养24 h后吸弃培养液，再加入CM （方法同上），液体总量为500 l/孔。培养至20 h 后，再每孔加入0.5 Ci/l00 l 的3H-TdR，继续培养4 h 后吸弃上清，胰酶消化，洗涤，超速离心过滤后将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，在60 恒温干燥箱内放置30 min 烘干，移至测量管内，用液闪计数仪测定每孔HSC的放射活性即每分钟脉冲数值（

17、cpm 值）。2.8  活化HSC 表达TGF-1 mRNA 的检测采用半定量RT-PCR 两步法和琼脂糖凝胶电泳实验检测。以-Actin 为内参照，以GenBank 库内TGF-1 的最新mRNA 序列为准，同源比较后使用软件Primer Premier 5.0 设计引物并合成引物序列：TGF-1 的上游引物为5'- CCGCAACAACGCAATCTATG-3'，下游引物为5'- AGCCCTGTATTCCGTCTCCTT -3'，产物片断长度为305 bp；参照文献7设计合成-Actin 引物：上游引物为5'-GGCATCCTGACCCT

18、GAAGTA-3'，下游引物为5'-GCCGATAGTGATGACCTGACC-3'，产物片断长度为565 bp。实验前将HSC以106 cells /孔密度接种于6 孔板中，培养24 h后吸弃培养液，加入CM（方法同上，液体总量为1.5 ml）。继续培养24 h 后吸弃CM，PBS 洗涤，加入RNAiso 试剂（1 ml/孔）充分裂解细胞。按试剂盒说明操作，提取细胞总RNA，紫外分光光度计测量吸光度值（OD 值）。提取的总RNA A260/A280 在1.61.8 之间，符合实验要求，而后进行逆转录反应。逆转录均采用随机引物（Olig dT），40 l 体系，反应条件均为：42 30 min，99 5 min，5 5 min，4 保存。PCR 反应体系为25 l （将试剂盒配量减半），上游和下游引物各加1 l，内参照-Actin 和目的基因不在同一反应管反应。-Actin 的反应条件为：94 预变性5 min，94 变性30 s，60 退火30 s，72 延伸1 min，30 个循环，最后72 继续延伸10 min，4 保存；TGF-1 的反应条件为：94 预变性5 min，94 变性30 s，60 退火4