浅论表面修饰对氧化铁纳米粒子类酶活性的影响

1、浅论表面修饰对氧化铁纳米粒子类酶活性的影响                    作者：杨婷,吴沂航,张晓庆,张宇,顾宁【摘要】  目的：研究表面修饰对氧化铁纳米粒子类酶活性的影响。方法：用共沉淀法制备Fe2O3纳米粒子，并用透射电子显微镜（TEM）表征。将Fe2O3纳米粒子分别表面修饰二巯基丁二酸（DMSA）、柠檬酸、酒石酸和3氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）,并用Zeta电位仪表征。由于Fe2O3纳米粒子可以催化双

2、氧水氧化底物3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB），从而发生显色反应，这一特性与辣根过氧化物酶（HRP）相似，通过岛津UV3600紫外可见分光光度计和酶标仪检测该显色反应，评估氧化铁纳米粒子的催化性能及表面修饰的影响。结果：（1） TEM和Zeta电位测量表明，Fe2O3纳米粒子直径约为13 nm，表面修饰能够有效调控其表面电荷；（2） 氧化铁纳米粒子类过氧化物酶催化活性与纳米粒子的表面电荷相关，表面负电荷有利于增加对带正电荷底物TMB的亲和力，从而增加类酶活性；（3） Fe2O3/DMSA具有最高的表面负电荷，米氏常数测量表明Km（TMB）为0.3 mmol·L-1，表现出与天然HR

3、P对底物TMB类似的亲和力。结论：通过表面修饰可以调控氧化铁纳米粒子的类酶活性，其作为HRP模拟酶具有潜在的应用价值。 【关键词】  氧化铁纳米粒子； 表面修饰； 辣根过氧化物模拟酶Abstract Objective:To investigate the effect of surface modifications on the peroxidaselike activity of iron oxide nanoparticles.Methods:Magnetic iron oxide nanoparticles were prepared by coprecipitation

4、method.The morphology of particles was observed by using TEM.The obtained Fe2O3 nanoparticles were modified with meso2,3Dimercaptosuccinic acid（DMSA）,citric acid,tartaric acid and 3aminopropyltriethoxysilanes(APTS),respectively,and the resultant products were characterized by zeta potential measurem

5、ents.Like horseradish peroxidase（HRP）,Fe2O3 nanoparticles were found to be able to catalyze a colour reaction of the substrate 3,3,5,5tetramethylbenzidine(TMB) in the presence of H2O2.The catalysis was evaluated by detecting the colour reaction using UVvisible spectrophotometer and microplat reader.

6、Results:(1) TEM measurements showed that the mean diameter of Fe2O3 nanoparticles was 13 nm.(2) The peroxidaselike activity of Fe2O3 nanoparticles was found to be related to their surface charge.TMB carries two amine groups,likely yielding stronger affinity toward a negatively charged nanoparticle s

7、urfaces.（3）Fe2O3/DMSA nanoparticles with the strongest negative surface charge exhibited the highest peroxidaselike activity than others when TMB acts as a substrate.The kinetic parameter of Fe2O3/DMSA nanoparticles were determined to be Km（TMB）=0.3 mmol·L-1,exhibiting a similar enzyme activity

8、 to the natural HRP.Conclusions:The peroxidaselike activity of Fe2O3 nanoparticles can be readily regulated by surface modifications,thus providing a potential advantage for application as a HRP mimic enzyme.Key words iron oxide nanoparticles; surface modification; HRP mimic enzyme   磁性氧化铁

9、纳米粒子因其具有多种独特的功能，在生物、医学、化学等领域受到广泛的关注。同一种磁性氧化铁纳米材料可以作为磁共振成像对比剂1-3、磁靶向药物载体4，可以用于细胞与生物分子分离5、生物传感与检测6，还可以作为磁感应肿瘤热疗的磁介质7。另外，在工业废水处理方面，磁性氧化铁纳米粒子因具有较高的有机物羟基化的活性而用于苯酚等有毒物质的清除（苯酚等有机物羟基化后毒性降低）8。在氧化铁磁性纳米粒子的应用方面，一个体系内同时发挥其多种功能的研究，是目前更具有发展前景的工作。   过氧化物酶是广泛存在于生物体内的一类氧化还原酶,通过其内部的变价铁元素以及外部结构能催化H2O2氧化氢供体底物。

10、在生命活动过程中,过氧化物酶主要是催化生物体内的氧化物或过氧化物氧化分解其他毒素。目前广泛应用的过氧化物酶是从天然植物中提取的辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)。HRP价格昂贵,且保存及实验条件苛刻，容易失活,在酶联免疫分析上因其分子较大而不利于抗原抗体结合,并且标记过程复杂。因此,寻找能够替代HRP的模拟酶是酶催化反应的热点9-10。   在众多酶模拟物中，Fe3O4磁性纳米粒子最近被发现能像Fenton试剂一样，表现出一定的类过氧化物酶活性，由此结合磁分离功能，能够发展可同时进行磁分离富集和免疫检测的方法11。由于Fe3O4纳米粒子稳定

11、性好、制备方法简单、成本低、易于大规模制备，同时还兼具有磁性等其他多功能特性，因此在医学、生物技术、环境化学等领域有广泛的应用价值。Fe2O3是另外一种磁性较强的氧化铁纳米粒子，可由Fe3O4纳米粒子直接氧化而来。由于Fe2O3磁性纳米粒子中只含有三价铁，因此，相对于Fe3O4纳米粒子来说不易被氧化，具有良好磁学和化学稳定性。但是由于Fe2O3磁性纳米粒子中缺乏二价铁，其本身类酶活性大大降低，从而严重限制了其作为模拟酶的应用。作者通过表面修饰，提高Fe2O3磁性纳米粒子类酶活性，从而得到一类稳定的、具有过氧化物酶活性的磁性Fe2O3纳米粒子。   1  材料与方法

12、1.1  主要试剂   3氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）及3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB）购自SigmaAldrich公司（美国）。30%H2O2、醋酸钠及冰醋酸购自国药集团化学试剂有限公司。FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、二巯基丁二酸（DMSA）、柠檬酸及酒石酸购自上海凌峰化学试剂有限公司。   1.2  实验方法Fe2O3磁性纳米粒子的制备及表面有机小分子修饰采用我们先前报道12-13的方法。（1） Fe2O3磁性纳米粒子的制备12。在N2保护下制备Fe3+（FeCl3·6H2O,0.

13、2 mol·L-1）和Fe2+（FeSO4·7H2O，0.13 mol·L-1）的混合溶液800 ml，将2.8 mol·L-1的氨水在剧烈的磁力搅拌下缓慢加入其中，直至pH=9，反应1 h，生成黑色沉淀，将生成物用永磁铁分离出来，反复用去离子洗涤4遍。将制备得到的Fe3O4产物定容到6 L，用HCl（0.2 mol·L-1）调节溶液pH值到3.0，待pH值稳定后水浴升温到90 ，鼓入过滤的空气进行氧化（90 min），从而得到Fe2O3纳米粒子。通过磁分离方法反复洗涤4遍后，定容约1 g·L-1，调pH=2.7。（2） Fe2O3/

14、DMSA磁性纳米粒子的制备12。称取60.69 mg DMSA，用DMSO溶解，机械搅拌下加入到400 ml Fe2O3磁性纳米粒子样品中，继续搅拌5 h，停止反应，磁分离洗涤沉淀物3次，加80 ml去离子水定容，用四甲基氢氧化铵调pH=6.5。（3） Fe2O3/柠檬酸磁性纳米粒子的制备13。称取52.6 mg柠檬酸，用10 ml去离子水溶解，机械搅拌下加入到400 ml Fe2O3磁性纳米粒子样品中，继续搅拌5 h停止反应，磁分离洗涤沉淀物3次，加80 ml去离子水定容，用四甲基氢氧化铵调pH=6.5。（4） Fe2O3/酒石酸磁性纳米粒子的制备13。取37.6 mg酒石酸，用10 ml去

15、离子水溶解，机械搅拌下加入到400 ml Fe2O3磁性纳米粒子样品中，继续搅拌5 h停止反应，磁分离洗涤沉淀物3次，加80 ml去离子水定容，用四甲基氢氧化铵调pH=6.5。（5） Fe2O3/APTS磁性纳米粒子的制备12。取800 ml Fe2O3磁性纳米粒子样品，用无水乙醇磁分离洗涤3次，定容至600 ml，充分超声。之后机械搅拌下在该反应体系中加入0.5 ml APTS，半小时后加去离子水100 l，继续搅拌3.5 h。停止反应后用无水乙醇磁分离洗涤沉淀物3遍，去离子水洗涤3遍，定容到160 ml，盐酸调pH=3.85。（1） 原子吸收测定Fe浓度：上述5个样品各取100 l，分别加

16、1 ml浓盐酸静置12 h，充分反应将氧化铁纳米粒子溶解为铁离子，再用去离子水定容至10 ml，待测。仪器型号为18080（日本Hitachi公司）。最终样品统一定浓度为2.3 g·L-1。（2） 透射电镜（TEM）表征：将Fe2O3样品用去离子水稀释后，滴1滴于TEM专用铜网上，40 下真空烘干8 h，待测。仪器型号为JEM200EX。（3） Zeta电位仪表征不同小分子对Fe2O3纳米粒子的修饰情况：将上述5个样品去离子水充分洗涤除去溶液中电解质，定容后待测。仪器型号为ZetaMaster3000。   1.3  小分子配体修饰的Fe2O3纳米粒子的

17、类过氧化物酶催化性能研究各个反应体系中，在石英比色皿内，分别取34 g磁性纳米粒子，溶于1 ml醋酸钠缓冲溶液（pH 4.6）中，加入50 l TMB溶液（10 mg·ml-1,溶于DMSO）和160  l的30%H2O2。用岛津UV3600紫外可见分光光度计测得显色反应10 min后的吸收光谱图。在各个反应体系中，分别取6.77 g不同有机分子修饰的Fe2O3磁性纳米粒子，溶于200 l醋酸钠缓冲溶液（pH 4.6）中，加入10 l TMB溶液（10 mg·ml-1,溶于DMSO）和32 l的30%H2O2。在BIORAD 680酶标仪检测650 nm下的光吸收

18、值，扫描时间为1 200 s，反应温度为25 。（1） TMB的米氏常数测定。取6.77 g  Fe2O3/DMSA磁性纳米粒子，溶于200 l醋酸钠缓冲溶液（pH 4.6）中，加入13 l的30%H2O2，分别加入不同量（0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 l）的TMB溶液（10 mg·ml-1,溶于DMSO），BIORAD 680酶标仪检测650 nm下的光吸收值，扫描时间120 s，反应温度25 。实验重复3次取数据。（2） H2O2的米氏常数测定。取6.77 g  Fe2O3/DMSA磁性纳米粒子，溶于200 l醋酸钠缓冲溶液（pH4.

19、6）中，加入5 l TMB溶液（10 mg·ml-1,溶于DMSO），分别加入不同量（0.7、1.3、2.6、5.2、7.8、10.4、13.0 l）的30%H2O2，在BIORAD 680酶标仪检测650 nm下的光吸收值随时间变化，反应温度25 。实验重复3次取数据。         2  结果与讨论   图1（A）是Fe2O3纳米粒子的TEM照片，图1（B）是由图1（A）统计出的Fe2O3纳米粒子的粒径分布。从图1中可以看出Fe2O3纳米粒子接近球形，平均粒子直径为13

20、 nm。   通常纳米粒子表面的修饰，可以达到以下目的：(1) 改善或改变纳米粒子的分散性；(2) 提高粒子表面活性；(3) 使粒子表面产生新的物理、化学、机械性能及新的功能；(4) 改善纳米粒子与其他物质之间的相容性。对氧化铁纳米粒子进行表面修饰可以增加其性能14。   为了对比配体修饰对Fe2O3纳米粒子催化活性的影响，我们分别用DMSA、柠檬酸、酒石酸及APTS对Fe2O3纳米粒子进行表面修饰，各小分子结构式见图2（A），结合图2（B）可知，修饰后氧化铁纳米粒子的表面电荷从负到正顺序为Fe2O3/DMSA的平均表二巯基丁二酸修饰的Fe2O3纳米粒子

21、（Fe2O3/DMSA）具有最高的表面负电荷是由于表面修饰过程中分子间形成了二硫键，导致二巯基丁二酸会以几聚体的形式化学吸附（通常是羧基或巯基与粒子表面铁原子形成配位键）到粒子表面，提供了  1吴媛，吴国球，刘乃丰，等.结缔组织生长因子单克隆抗体超微超顺磁氧化铁粒子的制备及其生物活性的研究J.东南大学学报：医学版，2009，28(4):321324.2曹烨,吴小涛,王运涛,等.骨髓间充质干细胞的体内示踪及其修复椎间盘退变的实验研究J.东南大学学报：医学版,2009,28(4):269273.3CLOULY C,POULINQUEN D,LUCET I,et al.Developmen

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