海藻酸钠包埋法制备固定化菠萝蛋白酶

1、海藻酸钠包埋法制备固定化菠萝蛋白酶第7卷第6期生物加工过程ChineseJournalofBioprocessEngineeringVo1.7No.6NOV.2009d0i:10.3969/j.issn.17623678.2009.06.006海藻酸钠包埋法制备固定化菠萝蛋白酶张琛,张宽朝,章琛,缪伟(安徽农业大学生命科学学院,合肥230036)摘要:以海藻酸钠为栽体,包埋法固定菠萝蛋白酶,对固定化奈件进行优化,同时探讨固定化菠萝蛋白酶的部分酶学性能.结果表明:固定化菠萝蛋白酶的质量受海藻酸钠质量分数,固定化酶量,固定化时间以及CaCI质量分数的影响,其最佳固定化条件为:海藻酸钠质量分数1.0

2、%,CaC1质量分数3%,固定化酶液量与海藻酸钠体积之比1:2,固定化时间60rain,在此条件下,制备的固定化菠萝蛋白酶的比活力为2l1.8U/g(湿质量载体),由此制得的固定化酶的最适pH为7.6,与游离酶相比,升高了0.8个pH单位,同时显示固定化菠萝蛋白酶能耐受较高的碱性环境,固定化酶最适温度与游离酶相同,均为5O,固定化酶在较高温度范围内,仍能保持较高的相对活力.关键词:海藻酸钠;固定化;菠萝蛋白酶中图分类号:Q8l4文献标志码:A文章编号:16723678(2009)06003l一04Immobilizationofbromelainbyembeddinginsodiumalgin

3、ateZHANGChert,ZHANGKuanchao,ZHANGChen,MIAOWei(CollegeofLifeScience.AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)Abstract:Sodiumalginatewasusedasacarrierfortheimmobilizationofbromelain.Theoptimumoperationconditionswereasfollows:theconcentrationofsodiumalginateandCaCl,solutionwere1.0%and3.0%,respecti

4、vely;theratioofenzymesolutiontosodiumalginatewas1:2;theimmobilizationtimewas60min.Undertheseconditions,theoptimumpHoftheimmobilizedenzymewasshiftedform6.8to7.6.andtheoptimumreactiontemperaturewas5O.Keywords:sodiumalginate;immobilization;bromelain菠萝蛋白酶存在于菠萝植株中,含有多种蛋白水解酶组分,对蛋白质及多肽具有催化水解活性,食品工业上用于啤酒澄清,

5、肉类嫩化及水解蛋白的生产等;医药上主要用于抗炎,消除水肿,烧伤后脱痂等'畜牧业中,菠萝蛋白酶可作为一种新型安全兽药'.但菠萝蛋白酶作为生物活性物质,易受有关因素的影响而失活.固定化酶与游离酶相比,具有热稳定性高,保存稳定性好,抵抗性强,不易水解以及对变性剂的耐受性好等特性,因而固定化技术成为生物酶得到广泛而有效利用的重要手段.制备固定化酶的方法主要有吸附,包埋,共价键结合和交联法等,其中包埋法不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基,具有反应条件温和,很少改变酶分子结构,酶活力损失小等优点一.固定化酶常用的包埋材料有很多,其中海藻酸钠最为常见,二价金属离子如Ca"与可溶性海藻

6、酸钠反应生成海藻酸钙微凝胶,无毒,安全,有良好的生物相溶性,可以在温和条件下实现对酶的固定,有助于保持酶的生物活性.此外海藻酸钠具有价格低收稿日期:20090330基金项目:国家自然科学基金资助项目(30570004);安徽农业大学校综合性实验项目作者简介:张琛(1968一),男,安徽淮南人.讲师,博上研究生,研究方向:生物化学与酶工程,E-mail:swzzcO1163.COIll32生物加工过程第7卷廉,材料易得等特点,因而受到广泛重视,已应用于药物缓释与食品,生物工程等领域.本文利用海藻酸钠为载体对菠萝蛋白酶进行固定化,分析固定化条件对菠萝蛋白酶活性的影响,同时对固定化酶的酶学性质进行初

7、步探讨,为菠萝蛋白酶的固定化制备提供参考依据.1材料与方法1.1主要材料与试剂菠萝蛋白酶参考文献9实验室自制;酪蛋白(进口分装),海藻酸钠,化学纯;三氯乙酸等试剂为国产分析纯.1.2主要仪器与设备紫外可见光分光光度计,南京第四分析仪器有限公司;HH一2数显恒温水浴锅,常州国华电器有限公司;FA2024A电子天平,上海精密科学仪器有限公司;pH213酸度计,上海精天电子仪器厂;离心沉淀器,长沙平凡仪器仪表有限公司.1.3实验方法1.3.1固定化菠萝蛋白酶的制备参考文献10制备固定化菠萝蛋白酶.1.3.2菠萝蛋白酶的活力测定参考文献1112进行菠萝蛋白酶的活力测定.酶活力单位定义:一个酶活力单位是

8、指在一定实验条件下(pH7.0,35oC时,一定底物浓度,反应体积,反应10rain)水解酪蛋白产生1tzg酪氨酸时所需要的酶量,单位U/g.固定化酶的相对活力是指在同组试验中以活性最高的为100,其余的固定化酶活力与之相比,以百分数表示.2结果与讨论2.1固定化条件对固定化酶活力的影响2.1.1海藻酸钠质量分数对固定化酶活力的影响将一定量酶液与不同质量分数的海藻酸钠溶液混合,测定固定化酶的活性.结果如图1所示.由图1可知,在海藻酸钠质量分数为1.0%时,固定化酶活力最大.当海藻酸钠质量分数过大时,其黏度很大,难以挤成球状,影响凝胶成型,同时凝胶的孔径也小,影响酶与底物的结合.反之海藻酸钠质量

9、分数太小,凝胶的孔径较大,固定化酶容易流失,也会影响酶活.因此,合适质量分数的海藻酸钠易形成机械强度适宜的凝胶,同时底物和产物10090!g80鳇70正6O500.51.O1.52.O2.53.0(海藻酸钠)/%图1海藻酸钠质量分数对固定化酶活性的影响Fig.1Effectsofsodiumalginateconcentrationonactivityofimmobilizedenzyme易于从凝胶微孑L扩散通过,酶促反应速度较快,所以选择海藻酸钠质量分数1.0%为宜.2.1.2酶量对固定化酶活力的影响用于固定化的酶量直接关系到固定化酶的活力,酶的加入量亦有一最佳值,将酶液量与质量分数为1%海

10、藻酸钠溶液按体积比1:1,1:2,1:3,1:4进行固定,测定固定化酶的活力,结果如图2所示.lo09O80星7o60501:21:31:4酶液):海藻酸钠)图2固定化酶量对固定化酶活力的影响Fig.2Effectsofdifferentenzymeamountsonactivityofimmobilizedenzyme由图2可知,当酶液量与海藻酸钠溶液体积比大于1:2时,固定化酶的活性下降,小于1:2时而略有降低,综合考虑,选择酶液量与海藻酸钠溶液的体积比为1:2为宜.2.1.3CaC1质量分数对固定化酶活力的影响CaCI,的质量分数对形成凝胶的机械强度有重要影响.CaC1:质量分数太大,过

11、多的Ca¨布满ca凝胶表面,由于Ca会与酶作用,从而降低酶活性,若太少又导致凝胶强度太小,包埋不完全,包埋在内部的部分酶会流失.将酶液与1%海藻酸钠溶液以1:2比例混合固定60min,测定固定化酶活力.结果如图3所示.由图3可知,CaC1质量分数为3%时,固定化酶活性达到最佳.第6期张琛等:海藻酸钠包埋法制备固定化菠萝蛋白酶图3CaC!:质量分数对固定化酶活性的影响Fig.3EffectsofCaC12concentrationonactivityofimmobilizedenzyme2.1.4固定化时间对固定化酶活力的影响固定化时间是海藻酸钠与固定化酶的混合液滴落到CaC1溶液中的

12、反应时问.以上述条件,取酶液与海藻酸钠溶液混匀,滴入3%的CaC1,溶液中,分别固定30,4O,5O,60,70,80,90min,测定固定化酶活力,结果如图4所示.l0o90衄踺晕80703040506070SO90timii1图4固定化时间对固定化酶活性的影响Fig.4Effectsofimmobilizedtimeonactivityofimmobilizedenzyme由图4可知:开始固定化时,固定化酶的活性呈升高趋势,到60min固定化酶活达到最大.随着固定化时间延长,固定化酶活性降低,这可能是因为随着固定化时间延长,交联程度高,高分子结构致密,底物扩散阻力增加.综合考虑上述不同因素

13、对固定化酶活性影响,在此优化条件下,制备的固定化菠萝蛋白酶活性为211.8U/g(湿质量载体)2.2固定化酶的酶学性质2.2.1温度对固定化酶和游离酶活力的影响在上述最佳固定化条件下,制备固定化酶,分别于30,35,40,45,50,55,60,65cc下测定固定化酶和游离酶活性,并计算相对活力,结果如图5所示.蜒避-,!x1()0908O7O603035404550556065:图5温度对固定化酶和游离酶活力的影响Fig.5Effectsoftemperatureonactivityofimmobilizedenzymeandliquidenzyme由图5可知,与游离酶相比,固定化后酶的最适

14、反应温度为50cc,最适反应温度没有改变,但固定化后酶在较高温度范围内,仍保持较高的相对活力,分析原因可能是固定化载体稳定¨r酶的空间结构,使酶对热的稳定性有所提高.2.2.2pH对固定化酶和游离酶活力的影响上述其他条件不变,反应温度为50qC,在不同pH的磷酸缓冲溶液中测定固定化酶和溶液酶活力,结果如图6所示.由图6可知,随着pH值的提高,固定化酶活性逐渐上升,其最适pH为7.6,而溶液酶的最适pH为6.8,固定化酶在pH7.28.0范围内,仍保持较高的相对酶活,这显示固定化酶比游离酶较耐碱,相比游离酶有更宽泛的适应性:可能原因是由于固定化后,载体对酶空间结构产生影响,带负电荷的载

15、体制备的固定化酶,最适pH向碱性偏移图6pH对固定化酶和游离酶活力的影响Fig.6EffectsofpHonactivityofimmobilizedenzymeandliquidenzyme3结论利用海藻酸钠作为载体制备的固定化菠萝蛋白酶的活力受海藻酸钠质量分数,固定化酶量,固舳634生物加工过程第7卷定化时间以及CaC1质量分数等因素的影响,其最佳固定化条件:海藻酸钠质量分数1.0%,固定化酶液量与海藻酸钠体积之比为1:2,固定化时间为60rain,CaC1,质量分数为3.0%,在此条件下,制备的固定化菠萝蛋白酶的比活力为211.8U/g(湿质量载体).固定化后的菠萝蛋白酶最适温度50,没

16、有发生改变,但固定化酶在较高温度范围内,仍能保持较高的相对活力;最适pH为7.6,与游离酶相比,升高了0.8个pH单位,同时显示固定化菠萝蛋白酶能耐受较高的碱性环境.本文仅对菠萝蛋白酶在海藻酸钠中固定化条件进行了初步探讨,分析了固定化后酶的某些特性,有关固定化菠萝蛋白酶应用条件及相关因素还有待进一步研究.参考文献:1章佩芬,郭勇,罗焕敏.菠萝蛋白酶的研究与应用进展J.华西药学杂志,2002,17(2):128129.ZhangPeifen,GuoYong,LuoHuanmin.ProgressinresearchandapplicationofbromelainJ.WestChinaJourn

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