C反应蛋白与肾小管间质纤维化关系研究

1、C反应蛋白与肾小管间质纤维化关系研究         08-11-29 10:31:00     编辑：studa20                  作者：李灿 ，金英顺 ，陈瑛，梁哲宇摘要 目的 探讨C反应蛋白（CRP）与慢性环孢素A（CsA）肾毒性肾小管间质纤维化的关系. 方法 给雄性Sprague-

2、Dawley大鼠皮下注射CsA4周，建立慢性CsA肾毒性动物模型.采用胶乳增强免疫比浊法、免疫比浊法以及免疫组织化学染色方法检测对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠血清高敏CRP（hs-CRP）、CRP及肾内CRP的水平;采用三色染色方法观察肾小管间质纤维化程度;以直线相关分析法对CRP与肾小管间质纤维化程度间的关系进行分析. 结果 慢性CsA肾毒性组与对照组血清CRP和hs-CRP的含量水平间无显著性差异，与肾小管间质纤维化程度无相关关系;慢性CsA毒性组大鼠肾内CRP的表达显著高于对照组，与肾小管间质纤维化程度呈正相关（r=0.862）. 结论 慢性CsA肾毒性肾小管间质纤维化与肾内CRP的表达

3、水平密切相关，与血清CRP的含量无关. 关键词  肾小管间质纤维化;C反应蛋白;大鼠    ABSTRACT:OBJECTIVE To study the relationship between C-reactive protein（CRP）and tubulointerstitial fibrosis（TIF）in a model of chronic cyclosporine（CsA）nephrotoxicity.METHODS Chronic CsA nephrotoxicity was induced in Sprague-Dawley rat

4、s by administering CsA for4weeks.Serum CRP，high sensitivity-CRP（hs-CRP），and intrarenal CRP of rats in control group and CsA treatment group were evaluated with particle-enhanced immunoturbidometric method and immunohistochemistry.TIF was measured by Masson trichrome stain.The relationship between CR

5、P and TIF was analyzed by the Pearson single-correlation coefficient.RESULTS There were no significant differences in CRP and hs-CRP levels between two groups.Moreover，there was no relationship between serum CRP and TIF，intrarenal CRP expression was markedly increased in CsA-treated rat kidneys comp

6、ared with control，and that was correlated with the TIF score（r=0.862）.CONCLUSION Intrarenal CRP level but not serum CRP is closely associated with TIF in chronic CsA nephrotoxicity.    Key words:tubulointerstitial fibrosis;C-reactive protein;rats    C反应蛋白（C-reactive pro

7、tein，CRP）是在急性炎症病人血清中发现的急性期蛋白，它可通过补体活化、组织损伤及内皮细胞活化等途径放大炎性反应.急性创伤或感染发生时，血CRP浓度急剧升高，可达到正常水平的1000余倍，病情好转时又迅速下降至正常水平.因此，CRP不但被认为是心血管及肾脏疾病的急性相反应指标，而且监测它还可预测相关疾病的病情严重程度 1 .本实验组曾利用动物模型研究发现，长期使用CsA可导致肾脏持续性炎症介质表达的上调及炎性细胞的浸润，此炎症反应与肾小管间质纤维化密切相关 24 .本研究通过检测大鼠血CRP水平，探讨了其与慢性CsA肾毒性肾小管间质纤维化间的关系.    1

8、材料与方法    1.1 动物模型的构建  取雄性Sprague-Dawley大鼠16只，体重为200220g，喂饲低盐饲料（0.5g/L钠盐，Teklad Premier，Madison，WI，美国），随机分为对照组及慢性CsA肾毒性组，每组各为8只.给对照组大鼠每日皮下注射1mL/kg橄榄油（Sigma），给慢性CsA肾毒性组大鼠每日皮下注射15mg/kg CsA（Novartis Pharma，Basel，瑞士），时间为4周.    1.2 肾功能测定  将大鼠放入代谢笼中，采血，收集24h尿液，用7150型

9、全自动生物化学分析仪测定血清肌酐（Scr）含量，用Jaffe比色法测定24h尿肌酐含量，用下列公式计算内生肌酐清除率（creatinice clearance，Ccr）: Ccr（%）=24h尿量×尿肌酐 血清肌酐 ×100    1.3 血清CRP含量的测定  采用胶乳增强免疫比浊法检测血清hs-CRP，CRP含量 5 .由韩国天主教大学江南玛丽医院梁哲宇教授提供原始数据.    1.4 肾脏病理检查  用碘酸-赖氨酸-多聚甲醛液（periodate-lysine-paraformaldehy

10、de，PLP）固定大鼠肾组织，石蜡包埋后切片，厚度为4m，脱蜡，行三色染色.肾小管间质纤维化程度判定:每张切片至少观察20个非重叠区域，用数字显微镜分析仪（Olympus，日本）以每个视野为100%利用Polygon    程序计算出纤维化百分率，并计算其平均值.  1.5 免疫组织化学染色  将石蜡包埋的切片置于二甲苯脱蜡，梯度酒精中脱水，在室温下经3g/L过氧化氢及100g/L甲醛处理30min，用PBS洗涤3次，置于微波炉中加热5min（抗原修复），用PBS洗涤3次，室温下滴加非免疫性血清封闭液处理20min，用PBS洗涤3次，在4条件下

11、滴加一抗（ED-1，Sigma，美国），在室温孵育1216h，用PBS液洗涤3次，滴加二抗，继续孵育23h，以DAB为底物显色至颜色呈棕黄色为止;自来水流水洗涤，复染苏木素，常规树脂封片，用数字显微镜分析仪计数ED-1，CRP阳性细胞数.    1.6 统计学处理  计量资料用均数±标准偏差表示（x±SD），两样本均数间比较采用t检验.CRP含量与肾小管间质纤维化程度的关系的分析用直线相关分析，采用SPSS12.0软件进行.    2 结果    慢性CsA肾毒性组大鼠肾功能

12、明显降低，表现为Scr为（109.3±11.7）mol/L，与对照组大鼠的（57.1±1.9）mol/L相比明显上升，Ccr为（1.5±0.2）mLmin -1 kg -1 ，与对照组大鼠的（5.1±0.6）mLmin -1 kg -1 相比明显下降，两组Scr，Ccr值间均有显著性差异（P<0.01）.慢性CsA肾毒性组大鼠肾组织肾小管间质纤维化百分率为36%±3%，而对照组大鼠则无肾小管间质纤维化（图1）;慢性CsA肾毒性组大鼠肾小管间质内可观察到大量的ED-1阳性细胞浸润（54个±9个），与对照组（11个±1个）

13、比较有显著性差异（P<0.01，图2）;对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠血清CRP含量分别为（21.6±1.14），（21.6±1.13）mg/L，Hs-CRP含量分别为（2.4±0.09），（2.5±0.19）mg/L，两组间无显著性差异（P>0.05）;免疫组织化学染色结果表明，慢性CsA肾毒性组大鼠肾内CRP表达及免疫活性明显增强，CRP阳性细胞数为（62±6）个，集中于受损区域的肾小管上皮细胞，对照组为（24±2）个，两组间有显著性差异（P<0.01，图3）.直线相关分析结果表明，血清CRP，hs-CRP含量与

14、肾小管间质纤维化程度无相关关系（r=0.054，P=0.844;r=0.027，P=0.919），而肾内CRP阳性细胞数与肾小管间质纤维化程度有较强的正相关关系（r=0.862，P<0.001）.  图1 三色染色所示对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠肾小管间质纤维化 ×100  图2 免疫组织化学染色所示对照组及慢性CsA肾毒  性组大鼠肾小管间质炎性细胞浸润 ×400  图3 免疫组织化学染色所示对照组及慢性CsA肾毒性组大鼠肾内CRP的表达 ×100     3 讨论