肺癌胸水间期细胞遗传学异常变化的研究

1、    肺癌胸水间期细胞遗传学异常变化的研究        【摘要】目的探讨肺癌胸水肿瘤细胞的间期细胞遗传学改变，并将其结果与传统细胞学结果进行比较。方法用7号、11号、17号、X染色体着丝粒特异的DNA探针，对26例肺癌胸水标本进行双色荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)。结果在19例肺癌阳性胸水标本中，7号、X、17号、11号染色体出现超二倍体的病例分别为16例(84.2%)、14例(73.7%)、12例(63.

2、2%)、8例(42.1%)。2例可疑癌胸水标本7号、X染色体也均表现为超二倍体。在5例肺癌阴性胸水中，有2例FISH结果X染色体出现超二倍体改变。其它3例阴性胸水以二倍体细胞为主。结论染色体超二倍体改变是肺癌胸水肿瘤细胞的重要特征，FISH技术可以检测胸水标本中的超二倍体肿瘤细胞，而且染色体超二倍体改变对临床没有发现的恶性肿瘤及诊断为可疑癌的病例有一定的提示作用。【关键词】荧光原位杂交；肺癌；胸水；超二倍体 Study on interphase cytogenetic abnormalities in malignant cells in pleural fluids from lung c

3、ancer casesJIA Donghui(Department of Cytology, Cancer Institute/Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021 P. R. China. E-mail: jiadh)ZHANG Zhihui(Department of Cytology, Cancer Institute/Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021 P. R. China. E-mail: jiadh)LI

4、U Sufan(Department of Cytology, Cancer Institute/Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021 P. R. China. E-mail: jiadh)CHENG Shujun(Department of Cytology, Cancer Institute/Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100021 P. R. China. E-mail: jiadh)【Abstract】Objecti

5、veTo study the interphase cytogenetic abnormalities in malignant cells in pleural fluids from lung cancer cases by fluorescence in situ hybridization(FISH) and compare the result of FISH with that of conventional cytology. MethodsTwenty-six pleural fluids from the lung cancer cases were detected by

6、dual-fluorescence in situ hybridization centromere DNA probes of chromosomes 7, 11, 17, and X. ResultsIn 19 positive pleural fluids the rates of hyperdiploid in chromosomes 7, X, 17 and 11 were 16(84.2%), 14(73.7%), 12(63.2%) and 8(42.1%), respectively. In 2 suspicious malignant pleural fluids, both

7、 chromosomes 7 and X showed hyperdiploid. Two cases of hyperplasia from 5 negative specimens also showed gain of chromosome X. Another 3 negative pleural fluids had a normal number of chromosome. ConclusionOne of the important abnormalities occurred in tumor cells derived from pleural fluid of lung

8、cancer is hyperdiploid, which can be detected by FISH. Therefore, hyperdiploid in pleural fluid cells can be an implication for the malignancy that has not been detected or confirmed by cytological examination.【Key words】fluorescence in situ hybridization;lung cancer;pleural fluids;hyperdiploid间期细胞遗

9、传学是应用染色体特异重复序列DNA探针结合原位杂交技术对未分裂细胞进行的细胞遗传学分析。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术是目前在细胞水平检测染色体数目异常的有效方法。其优点是不必进行细胞培养和染色体制备来分析染色体数目和结构异常。许多研究表明1，2，FISH技术可以作为传统细胞学诊断的辅助手段来鉴别正常与肿瘤细胞。我们利用7号、X、11号、17号染色体着丝粒特异的DNA探针来检测肺癌胸水中的超二倍体肿瘤细胞，并将其结果与传统细胞学诊断进行比较。1材料与方法1.1肺癌胸水标本由中国医学科学院肿瘤医院临床细胞学室提供，共26例。每

10、例标本均由两位细胞学专家进行细胞学诊断，见表1。分3组：(1)肺癌阳性胸水，共19例(病例119)；(2)肺癌可疑癌胸水，共2例(病例20，21)；(3)肺癌阴性胸水，共5例(病例2226)。1.2探针、标记及检测试剂，见表2。1.3标本制备离心胸水收获细胞；加入37 预温的低渗液(0.075 mol/L KCl)，37 低渗20 min，然后加入固定液(31甲醇乙酸)预固定(固定液终浓度：体积分数为10%)，离心弃上清。加入上述固定液室温固定20 min，离心弃上清，重复2次。用少量固定液重悬细胞，滴在已涂有多聚赖氨酸的载玻片上，自然干燥。表126例肺癌胸水染色体数目变化结果Table 1

11、The result of numerical chromosomal abnormality in 26 cases of pleural fluids from lung cancerCase(病例)Cytologic diagnosis(细胞学诊断)Sex(性别)Chromosomes(染色体)71117X1AdenocarcinomaM+-+2AdenocarcinomaM+0+3AdenocarcinomaM+/-+4Alveolar cell carcinomaF+00+5AdenocarcinomaF+6Cancer cellsM+-0-7Considered squamousM

12、+cell carcinoma8AdenocarcinomaF+0+/-+9ConsideredF+0adenocarcinoma10Cancer cellsM+0+11Malignant cellsF-+-+12Malignant cellsF+0+13Malignant cellsM+-+14AdenocarcinomaF+00015AdenocarcinomaF+16ConsideredM-+-adenocarcinoma17Cancer cellsM000018AdenocarcinomaM+-0+19Cancer cellsM+0+20Suspicious cancer cellsM

13、+21Suspicious cancer cellsF+22No cancer cellsF0-023Mesothelial hyperplasiaF+24No cancer cellsM000025Mesothelial hyperplasiaM000026Considered tuberculosisM0000+:hyperdiploid(超二倍体)；-：hypodiploid(低二倍体)；0：diploid(二倍体)；M:male(男)；F:female(女)；adenocarcinoma(腺癌)；squamous cell carcinoma(鳞癌)；alveolar cell car

14、cinoma(肺泡细胞癌)；considered squamous cell carcinoma(考虑鳞癌)；considered adenocarcinoma(考虑腺癌);cancer cells(癌细胞)；malignant cells(恶性细胞)；suspicious cancer cells(可疑癌细胞)；no cancer cells(未见癌细胞)；mesothelial hyperplasia(间皮细胞增生)；considered tuberculosis(考虑结核) 1.4杂交探针杂交液混合物配制杂交前将标记好的探针用杂交液(体积分数为55%甲酰胺，1×SSC，10 g

15、/L硫酸葡聚糖，1 g/L鲑鱼精DNA)配成2×10-5 g/L的杂交混合物。探针变性：配好的探针杂交液混合物于75 水浴变性10 min，然后立即入冰。杂交前标本的处理：70%乙酸处理10 min，PBS洗5 min×3次。乙醇梯度脱水，风干。70%甲酰胺-2×SSC中75变性4 min，立即放入70%，90%，100%乙醇脱水各3 min，风干。杂交：将变性过的探针加到上述变性的标本上，Rubber Solution封片，置温盒中于37 杂交过夜。杂交后洗涤：杂交完毕后，片子在42 的50%甲酰胺-2×SSC中洗5 min×3次，2

16、5;SSC中洗5 min×3次。检测：室温下在4×SSCT(4×SSC 0.1%Tween 20)中洗3 min。加4×SSCB(4×SSCB-0.5 g/L Blocking Reagent-0.02 g/L NaN3 Boehringer Mannheim, Germany)室温封闭20 min。加Avidin-FITC(5×10-3 g/L-4×SSCB Vector Laboratories Inc., USA)室温封闭20 min。置温盒中于37 孵育40 min。4×SSCT洗5 min×3次

17、。加Biotinylated goat anti-avidin抗体(5×10-3 g/L-4×SSCB Vector Laboratories, USA)置温盒中于37 孵育40 min。4×SSCT洗5 min×3次。加Avidin-FITC(5×10-3 g/L-4×SSCB)与Anti-Digoxigenin Rhodamine(2×10-2 g/L Boehringer Mannheim, Germany)的混合液，置温盒中于37孵育40 min。4×SSCT洗5 min×3次。梯度乙醇脱水，风干

18、。加DAPI复染。1.5对照研究上述4种人染色体特异探针与6名健康人(其中男性3名、女性3名)的外周血细胞中期分裂染色体杂交，以确证各探针杂交的特异性，并计数400个细胞中具有1个杂交信号，以及3个杂交信号的细胞比例，用以计算每个探针具有1个杂交信号和3个杂交信号的细胞的99%可信限(上限)作为判定标本中异倍体的标准。我们选择具有某一异常数目的细胞所占的比例10%作为判定异倍体的标准。之所以选择10%是因为在对照研究中具有异常杂交信号的比例细胞计算出的99%的可信限远小于10%。这一标准与文献3中判定异倍体的标准是一致的。1.6质量控制每一批杂交实验都带一张正常血细胞的染色体片。若杂交后，正常

19、染色体片中各探针具有2个杂交信号(男性中X染色体为一个信号)的比例明显低于对照研究中的平均比例，或杂交信号很弱，难以辨别，则视该次杂交失败，弃之重新杂交。表2双色FISH中染色体DNA探针的标记和检测Table 2 Labelling and detection of chromosomal centrometric DNA in the dual-color FISHGroup(组别)Chromosome(染色体)Labelled reagents(标记试剂)Detected reagents(检测试剂)Signal colors(信号颜色)A17Digoxigenin-11-dUTPAnt

20、i-digoxigenin-RhodanmineRed11Biotin-16-dUTPAvidin-FITCGreenBXDigoxigenin-11-dUTPAnti-digoxigenin-RhodamineRed7Biotin-16-dUTPAvidin-FITCGreenRed(红色)；Green(绿色)；Digoxigenin-11-dUTP(地高辛-11-尿嘧啶核苷酸)；Anti-digoxigenin-Rhodanmine(罗丹明标记的抗地高辛抗体)；Biotin-16-dUTP(生物素-16-尿嘧啶核苷酸)；Avidin-FITC(亲和素-荧光素异硫氰酸盐) 1.7镜下观察并计

21、数杂交后用Nikon荧光显微镜配以FITC/TEXAS RED/DAPI三色滤光片观察结果，用ECTASCHROME400ASA彩色负片摄影记录。杂交信号的判定参照Hoppman等4的标准，每一个标本在计数300个细胞中两探针具有的杂交信号的数目，并计算其占总计数细胞的百分比。破损、重叠、边界不清、具有明显非特异性杂交背景和信号模糊不清的细胞不计在内。相差一个信号间距两点判断为2个信号。2结果4个染色体探针在26例肺癌胸水标本中的杂交结果，见表1。在19例肺癌阳性胸水标本中，7号、X染色体出现超二倍体的病例分别为16例(84.2%)、14例(73.7%)，17号、11号染色体超二倍体的标本也占

22、有相当高的比例，分别达到12例(63.2%)、8例(42.1%)，此结果说明染色体超二倍体改变在肿瘤中是一种常见现象(1)。但病例17中4个染色体拷贝数均未出现改变。2例可疑癌胸水标本(病例20、21)也均表现为7号、X染色体超二倍体。在5例阴性胸水中，有2例(病例23、25)细胞学诊断为间皮细胞增生，病例23原位杂交结果7号、X染色体出现超二倍体改变，经复查后，发现此病例为腺癌(2)，其先前肺癌术后病理结果也为腺癌。病例25原位杂交结果只有X染色体表现超二倍体改变，复查后，发现有1个可疑癌细胞，支气管镜活检结果：见有少许破碎的鳞癌细胞。其它3例阴性胸水超二倍体的细胞不超过10%(3)。由此可

23、以看出FISH结果与细胞学结果不仅具有高度的一致性，而且对于细胞学没有发现的恶性病例及诊断为可疑癌的病例给予一定的提示作用。1肺腺癌胸水标本7号(绿)，X(红)染色体双色荧光原位杂交，染色体超二倍体×15002肺癌胸水标本原诊断为间皮细胞增生，经复查后诊断为腺癌，双色荧光原位杂交，11号染色体(绿)二倍体，17号染色体(红)超二倍体×15003阴性胸水标本11号(绿)，17号(红)染色体双色荧光原位杂交，染色体二倍体×1500Fig 1 Pleural fluids from the lung adenocarcinoma detected by dual-FIS

24、H chromosomes 7 (green) and X(red) showed hyperdiploid.×1500Fig 2 Pleural fluids from the lung cancer detected by dual-FISH Chromosomes 11(green) and 17(red) were diploid and hyperdiploid, respectively. Their previous cytologic diagnosis was hyperplasia. Then they were reexaminated and diagnose

25、d as adenocarcinoma.×1500Fig 3 Negative pleural fluids detected by dual-FISH Chromosomes 11(green) and 17(red) were diploid.×15003讨论在19例肺癌阳性胸水标本中4个染色体拷贝数都表现不同程度的增加，说明胸水中肿瘤细胞具有多个克隆。7号、X染色体出现超二倍体的比例最高分别为84.2%(16/19)、73.7%(14/19)。从结果百分比可以看出，FISH结果与细胞学结果具有很好的一致性，可以进一步确证细胞学诊断结果。病例17中4个染色体拷贝数均未出

26、现改变，但这并不能排除其他染色体出现超二倍体改变。2例可疑癌的胸水标本4个染色体也均表现超二倍体。在5例阴性胸水中，有2例(病例23，25)细胞学诊断为间皮细胞增生，病例23原位杂交结果7号、X、17号、11号染色体均出现明显超二倍体改变，具有超二倍体的细胞比例达到30%50%。经复查，发现病例23为腺癌，先前肺癌术后病理结果也为腺癌。病例25原位杂交结果X染色体出现超二倍体改变的细胞比例是10.8%，而其他3个染色体以二倍体为主，复查后，发现有一个可疑癌细胞，它的支气管镜活检有少许破碎的鳞癌细胞。其它3例阴性胸水超二倍体的细胞不超过10%。对于这2例细胞学漏诊的阳性病例，可能由于胸水中含有大

27、量的良性细胞，而肿瘤细胞的数量较少。这种情况下，肿瘤细胞很容易被阅片人漏掉。我们的结果表明，FISH技术检测染色体超二倍体改变，对于细胞学没有发现的恶性肿瘤及诊断为可疑癌的病例给予一定的提示作用。Chen等7与Cajulis等8的研究也支持本室验结果。总之，染色体超二倍体改变是肺癌胸水肿瘤细胞的主要特征，荧光原位杂交技术可以检测胸水标本中的超二倍体肿瘤细胞，而且染色体超二倍体改变对临床没有发现的恶性及诊断为可疑癌的病例可有一定的提示作用。 作者单位：贾东辉（100021 北京，中国医学科学院肿瘤医院临床细胞学室）张智慧（100021 北京，中国医学科学院肿瘤医院临床细胞学室）刘树范（

28、100021 北京，中国医学科学院肿瘤医院临床细胞学室）程书钧（100021 北京，中国医学科学院肿瘤医院临床细胞学室）参考文献1，Wolman SR. Application of fluorescence in situ hybridization techniques in cytopathology. Cancer Cytopathol, 1998, 84193-197.2，Abati A, Sanford JS, Fertsch P, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): a user'guide to optimal preparation of cytologic specimens. Diagn Cytopathol, 1995, 13486-492.3，Veltman JA, Hopman ANH, Bo