纳米脱钙骨基质的制备及其性能检测

1、纳米脱钙骨基质的制备及其性能检测         10-04-30 15:20:00     编辑：studa20                 作者：黄凯，陈雄生，贾连顺，邵将，朱巍，严望军，房雷  【摘要】  目的通过MICROS超细粉碎机制备同种异体纳米脱钙骨基质(DBM

2、)，观察纳米DBM结构特征，研究DBM纳米化工艺及其作为骨移植替代物的生物相容性。方法采用改良Urist法制备同种异体脱钙骨基质，液氮冷冻球磨机将块状DBM预粉碎，使用MICROS超细粉碎机进一步研磨粉碎制备纳米DBM。电镜扫描观察其结构，按照我国卫生部生物材料和医疗器材生物学评价的技术要求中的标准，对纳米DBM进行急性毒性实验、热原实验、溶血实验等检测。结果制备颗粒直径在50200纳米的脱钙骨基质，生物相容性检测无毒性，无热源性，不引起溶血反应，纳米DBM具有良好的生物相容性。结论纳米DBM可在低温或控制温度条件下制备，是一种无毒、无刺激，不含热源、不引起免疫排斥反应的生物材料，具有良好生物

3、相容性。 【关键词】  纳米脱钙骨基质; MICROS超细粉碎机; 显微特征; 生物相容性Abstract: ObjectiveTo observe the structure characteristics of nano decalcified bone matrix (DBM) produced by MICROS super fine mill, and to study the nano-technologies of DBM and the biocompatibility of nano-DBM as bone graft substitutes. MethodsImp

4、roved Urist method was used to produce DBM. The pieces of DBM was pre-porphyrizated by liquid nitrogen frozen ball mill equipment. The DBM powder were further porphyrizated by MICROS super fine mill to be nano-DBM. The structure of nano-DBM was observed by electron microscope.The experiments on acut

5、e toxicity, pyrogen and hemolysis were performed according to theTechnical Evaluation Standards of Biomedical Materials and Medical Instruments promulgated by Chinese Ministry of Health.ResultsThe DBM was porphyrizated to the size of 50-200 nm in diameter. No toxicity, pyrogen nor hemolysis of nano-

6、DBM was noted. Nano-DBM exhibited excellent biocompatibility.ConclusionNano-DBM produced under the conditions of low or controlled temperature, is a kind of biomaterial which is avirulent, nonirritant, nonpyrogenic, nonimmunological reaction and reveals good biocompatibility.Key words：nano-DBM; MICR

7、OS; micro-characteristic;biocompatibility随着对疾病认识程度的加深及外科技术的发展，临床上对骨移植的需求量越来越大1。据统计，在美国每年约施行42万余例植骨融合术，其中60%以上为脊柱融合术。用于脊柱融合术的骨移植替代物和促进骨融合相关产品的医疗市场达420亿美元2。按此估算，我国每年实施的脊柱融合术数量不亚于这一数字，其未来的骨移植材料市场需求极大。目前国内外骨移植的材料主要包括自体骨、异体骨和合成骨替代材料3大类。自体松质骨，特别是自体髂骨被认为是骨移植材料的金标准，但其也存在供骨量及供骨尺寸和大小有限、手术时间延长、患者创伤增加、供骨区并发症等缺点

8、3。同种异体脱钙骨基质是经过特殊处理制成的一类异体骨，是由胶原蛋白、非胶原蛋白以及较低浓度的生长因子等组成的复合物，是异体骨移植替代材料中免疫源性最弱的一种。不同条件制备的脱钙骨基质存在骨诱导和骨传导性能的差异，另外由于脱钙骨基质失去了绝大部分的无机成分，其生物力学特点几乎完全消失，不适用于需要承受重力和其他任何应力的部位。研究、制备理想的骨移植材料替代自体骨用于骨缺损修复是目前医学和生物材料科学的重要课题。随着纳米科技及纳米医学的飞速发展4，纳米骨移植材料的相关研究发展态势迅猛5。本文使用MICROS超细粉碎机在室温环境下将人同种异体脱钙骨基质粉碎至纳米颗粒，并就纳米脱钙骨基质的制备工艺、生

9、物相溶性进行探索，为纳米脱钙骨基质(Nano-DBM)作为一种新的骨移植替代物及骨生长因子载体进一步在临床推广应用提供理论基础。1 材料和方法1.1 MICROS超细粉碎机6制备纳米DBMMICROS超微粉碎机是由日本研制的粉碎设备，研磨部件由定子和转子组成。定子即圆形容器，转子由主轴与多根副轴相连，每个副轴上都有多个研磨环，每个研磨环均可独立转动，各个研磨环之间有微小间隙。将研磨原料和研磨介质放入容器内，主轴带动副轴以相同的角速度旋转，副轴上的研磨环有公转和自转。副轴旋转产生的离心力使研磨环产生径向位移，与筒壁接触，夹在研磨环与筒壁间的材料以及夹在2个研磨环之间的材料同时受到挤压、剪切力的作

10、用而被粉碎。通过调整变压器可控制主轴的转速;容器内温度被实时监测，防止研磨时间长导致材料升温。采用手术时切除下来的人体骨，采用改良Urist法6制备脱钙骨基质。将制得的DBM颗粒与钢质研磨球一同放入液氮冷冻球磨粉碎机的容器内，持续注入液氮条件下以800 RPM研磨2 h。研磨完成后使用网筛将DBM粉末与研磨球分离。将液氮冷冻粉碎所得DBM粉末置于MICROS粉碎机的容器内，加入适当的蒸馏水，以1 200 r/min的最佳工作转速进行分时间断研磨，期间取样送激光粒度仪进行检测，研磨完成后取样送电镜扫描。MICROS粉碎机初始研磨温度为17，工作中最高温度为25，研磨时由循环水进行冷却降温。粉碎过

11、程中由激光粒度仪测量纳米DBM溶液，观察溶液内颗粒直径变化趋势。研磨结束后将匀浆进行高速离心取得纳米DBM，将之塑形后置于37恒温干燥箱内干燥，最终制得纳米DBM。样品经电镜扫描观测颗粒直径及表面结构。1.2 生物相容性检测取健康成年小鼠10只，雌雄不限，体重2530 g，随机分为实验组和对照组，实验组腹腔内注射浸提液(50 ml/ kg体重)，对照组腹腔内注射生理盐水(50 ml/ kg)。实验前后均用市售饲料饲养，观察注射后24、48、72 h小鼠的精神状态、进食量等指标。7 d后在同样室温和湿度下，再次测家兔肛温2次，间隔1 h，取平均值为正常体温;自家兔耳沿静脉推注温度为37的DBM浸

12、提液(10 ml/ kg体重)，注射后每小时测肛温1次，共3次，以3次中最高的一次减去正常体温，即为该家兔的体温升高度数。实验组：取纳米DBM 1份约5 g，浸泡于含有10 ml生理盐水的试管内,37水温中维持30 min，然后加入0.2 ml稀释兔血，缓慢混合，在37水温中维持60 min;阴性对照组：在10 ml生理盐水中加入0.2 ml稀释兔血;阳性对照组：在10 ml蒸馏水中加入0.2 ml稀释兔血，轻轻振动，使之完全溶血。阴性和阳性对照均为3只试管,保温条件与实验组相同。以2 000 r/min×5 min将所有试管离心，取上清，用分光光度计于波长545 nm测吸光度，每组取3只试管平均值。溶血程度按以下公式计算：溶血程度= (实验组吸光度-阴性对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光