脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

1、脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响                 【摘要】 目的：探讨脉冲电磁场（PEMFs)对大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）的影响. 方法：用全骨髓贴壁法分离rMSCs，对其进行1 Hz和15 Hz的PEMFs刺激，MTT法测定细胞增殖水平，检测碱性磷酸酶活性，进行四环素荧光染色和钙结节染色. 结果：rMSCs经PEMFs刺激后，各实验组细胞增殖水平均有不同程度提高，差异具有统计学意义（P<

2、;0.05），其中1 Hz，0.4 mT组改变最为明显（3 d，0.323±0.051；5 d，0.714±0.058），对照组（3 d，0.246±0.044；5 d，0.487±0.064），差异具有统计学意义（P<0.01）；碱性磷酸酶检测实验组水平升高（5 d，0.348±0.032；15 d，2.339±0.034），对照组（5 d， 0.205±0.026；15 d，0.533±0.013），差异具有统计学意义（P<0.05）， 四环素荧光染色和钙结节染色结果均呈阳性. 结论：rMSCs经P

3、EMFs刺激后，能促进体外培养rMSCs的增殖水平及成骨分化，磁场参数对实验结果有影响. 【关键词】 脉冲电磁场；骨髓间充质干细胞；增殖；成骨细胞0引言骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于骨髓基质系统中，具有自我更新能力和多向分化潜能，免疫原性弱1-3. 脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields，PEMFs) 能够促进活细胞增殖及分化，刺激骨局部因子的产生，改善骨密度和生物力学特性4，用于骨折延迟愈合、骨不连、骨质疏松症等骨科疾病5. 近年来，国内学者在这方面开始了大量研究工作，认为MSCs经12 Hz，1.1 mT的P

4、EMFs合理刺激后，细胞增殖加速，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性6. 利用恒磁场作用于骨组织中细胞，发现恒磁场处理可以促进MSCs向成骨方向分化7. 本实验通过观察rMSCs在低频率PEMFs的作用下增殖水平变化和细胞分化情况，以了解不同参数的PEM ( 脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响) Fs对rMSCs产生的影响.1材料和方法1.1材料1.2方法断颈处死大鼠，无菌条件下取其股骨和肱骨. 在PBS中将骨剪成12 mm3的小块，100目筛网过滤后移入离心管中，1200 rpm离心5 min，弃上清，重悬浮于4 mL低糖DMEM中. 72 h后换液.进行PAS过碘酸雪夫氏

5、染色、油红O染色和碱性磷酸酶（ALP）染色.将原代细胞以5×106 cells/孔接种在24孔板上，第4日开始，每日消化3个孔，分别计数，求平均值绘制生长曲线. 将第3代细胞以1×104 cells/孔接种在24孔板上，第2日开始以同上方法绘制生长曲线.PEMFs发生仪频率：15 Hz，1 Hz；磁感应强度：00.8 mT可调；线圈直径：200 mm. 调整两线圈距离至100 mm. 将线圈放置在孵箱中，刺激时将细胞放置在两线圈中间位置. 调整需要的强度和频率，刺激结束后，将对照组放在同样位置相同时间. 刺激时间为每次3 h，1次/d.细胞增殖将rMSCs以1×1

6、04 cells/mL接种于7个96孔板中，每板接种32孔. 刺激方式为：T0组(对照组)；T1组(15 Hz，0.2 mT)；T2组(15 Hz，0.4 mT)；T3组(15 Hz，0.8 mT)；T4组(1 Hz，0.2 mT)；T5组(1 Hz，0.4 mT)；T6组(1 Hz，0.8 mT)，连续作用5 d. 接种第2日开始PEMFs作用. 第3日每板选择16孔，加MTT（5 g/L）20 L，37孵育4 h，弃上清，加入DMSO 150 L，振荡10 min，测定490 nm波长时各孔的吸光度A值. 第5日对其余孔做同样检测.将rMSCs以每孔1×104 cells/mL接

7、种于6个24孔板中，每板接种8孔，分为2组，每组3个板. 刺激方式为：T0组(对照组)，T1组(1 Hz，0.4 mT). 接种第2日开始PEMFs刺激，连续刺激15 d. 第3日选两个板，测定ALP活性. 第5日和第15日各检测2个板.将rMSCs以3×104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 第2日开始对实验组进行PEMFs刺激，每天刺激结束后，关闭仪器电源，将对照组放在相同位置相同时间. 培养18 d后对细胞进行四环素荧光标记. 荧光显微镜下观察并采集图像.将rMSCs以5×104 cells/mL接种于2个6孔板中，分为对照组与实验组. 接种

8、第2日开始PEMFs作用，对照组处理同前. 28 d后，用茜素红S染液进行钙结节染色. 倒置显? ) 迪鹿鄄觳杉枷?统计学处理：数据以x±s表示，应用SPSS 12.0统计软件进行分析，采用SNKq检验和方差分析. 以P<0.05为有统计学意义.2结果2.1形态学观察及生物学鉴定接种前3 d可见大量大小不一，圆形悬浮细胞. 第5日大部分细胞呈成纤维细胞样，第7日后，可见梭形细胞，部分形成集落，排列呈规则的辐射状. 经23次纯化处理，细胞形态趋于单一化，以梭形、三角形为主，呈集落生长趋势（图1）. 染色结果均为阴性，说明细胞不能分泌糖原、未向脂肪细胞及成骨细胞分化.2.2rMSC

9、s生长曲线的绘制细胞生长曲线呈“S”形，具有稳定的潜伏期、对数增长期和平台期. 可见传代细胞生长周期明显比原代细胞短（图2）.23PEMFs对rMSCs增殖水平的影响2.4ALP活性检测经2.5四环素荧光标记细胞8 d左右呈梭形分布，并出现融合，约16 d左右出现结节状物. 继续培养可见复层生长. 持续培养，中心出现圆形细胞结节. 培养21 d时，尚无明显钙结节出现. 但四环素荧光标记后，镜下细胞周围基质聚集区呈明亮的黄色荧光区，阳性面积约占（10.1±1.2）%；对照组阳性面积约占（2.3±0.7）%. 两者之间差异具有统计学意义（P<0.01，图3）.2.6钙结节

10、染色结果持续培养32 d后进行钙结节染色，可见钙结节成橘红色，大小、形态各不相同，边界清晰，呈火山状突起，中间有黑色不透光颗粒，周围为橘红色，由中间向周边颜色逐渐变浅，阳性面积约占（15.3±0.6）%；对照组阳性面积约占（9.6±0.8）%. 两者之间有显著差异（P<0.01，图4）.3讨论本实验采用全骨髓贴壁法，在冲洗骨髓腔时某些滋养细胞和细胞因子会同时被冲出，与MSCs一同培养，可促使MSCs生长增殖旺盛，活力相对较强. 目前该类方法通常采用的是成年大鼠，虽然成年大鼠可以获得较多的骨髓量，操作也相对方便，但成年大鼠体内MSCs的含量更少，增殖能力也较年幼的动物差

11、，为此，我们采用了1215 d的大鼠. 根据生长曲线，选取34 d的传代细胞用于实验. MTT实验      结果显示T5组可以显著提高rMSCs增殖水平，提示该刺激参数可能是PEMFs刺激MSCs生长与增殖的一个“窗口”. 本实验中，PEMFs作用3 d后，T1，T2，T4组均未能表现出提高细胞增殖水平的作用，但在作用5 d后，各组细胞增殖水平均有提高，说明对于不同的频率和场强，细胞需要不同的刺激时间，才可以对PEMFs产生有效的反应. 倒置相差显微镜下观察到经PEMFs作用的rMSCs体积明显较对照组大，细胞增殖能力旺盛，传代周期明显缩短，培养2 （

12、脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响(3) 3 d即可进行传代处理.PEMFs作用促进成骨细胞增殖、分化，加速了体外骨形成8. ALP是成骨细胞的早期标志酶，可标志成骨分化的开始. 有研究发现，MSCs向成骨细胞分化的过程中，ALP水平有时间依赖性，随着诱导时间的延长表达量增加9. 本实验结果显示，经过5 d的刺激， rMSCs中可检测到ALP的表达，并随时间延长，表达水平逐渐增高，说明rMSCs向成骨细胞分化，并开始分泌骨基质. PEMFs刺激18 d，四环素荧光标记可观察到相当数量和面积的特征性金黄色，进一步证实rMSCs向成骨细胞分化，并促进了成骨细胞的体外骨形成. 继续

13、刺激，可肉眼观察到圆形或卵圆形的矿化小结，经茜素红染色为阳性，对照组也出现弱阳性反应. 可能的原因是由于培养液或血清的诱导，也可能是由于体外获取的原代细胞含有少量成骨细胞，rMSCs的分离方法还需要进一步改进.PEMFs有促进rMSCs增殖和成骨分化两方面的作用，是PEMFs有效治疗骨折、骨质疏松等骨科疾病的可能机制之一. 但是将PEMFs用于促进rMSCs增殖以获得大量组织工程种子细胞的时候，需要找到更好的磁场参数和培养条件，控制rMSCs的分化，这些都有待今后进一步深入探讨.【参考文献】1Sudeepta A, Pittenger MF. Human mesenchymal stem ce

14、lls modulate allogeneic immune cell responses J. Blood, 2005, 105（4）: 1815-1822.2庞永刚, 崔彭城, 陈文弦, 等. 人骨髓间质干细胞作为骨、软骨组织工程种子细胞的实验研究J. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(3): 306-309.3曹丰，贾国良，牛丽丽，等.移植时机对骨髓间充质干细胞修复梗死心肌的影响J. 第四军医大学学报，2005，26（1）：22-27.4罗二平，焦李成，申广浩，等. 不同强度脉冲电磁场对兔股骨骨密度及生物力学特性的影响J. 生物医学工程学杂志，2005，22（6）：1168-11

15、70.5Simmons JW Jr, Mooney V, Thacker I. Pseudarthrosis after lumbar spine fusion: Nonoperative salvage with pulsed electromagnetic fieldsJ. Am J Orthop，2004, 33(1): 27-30.6赵敏，许建中，周强，等. 脉冲电磁场促进人骨髓间充质干细胞成骨的研究J.中国矫形外科杂志, 欢迎您访问脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响(4) 2004，12(6):439-443.7张小云，张宇. 恒定磁场对骨组织中细胞影响的研究J. 中国骨质疏松杂志，2006， 12（4）：333-337.8李丽荣，罗二平，申广浩，等.低强度脉冲电磁场对大鼠成骨细胞的影响J. 第四军医大学学报，2005，26（6）：571-573.9Sammons J, Ahmed N, ElSheemy M，et al. The role of BMP6, IL6, and BMP4 in mesenchymal stem celldependent bone development: Effects on osteoblas