纳洛酮对大鼠脑复苏后细胞凋亡基因调控机制的实验研究

1、纳洛酮对大鼠脑复苏后细胞凋亡基因调控机制的实验研究                 【摘要】 目的 观察盐酸纳洛酮对大鼠脑复苏后海马CA1区细胞凋亡及其相关调控基因蛋白表达的影响，探讨盐酸纳洛酮脑保护的分子生物学机制。方法 将大鼠随机分成假手术组、单纯脑缺血再灌注组和脑复苏盐酸纳洛酮治疗组，制作大鼠脑缺血再灌注模型，分别用TUNEL和免疫组化法检测各组动物脑复苏后海马CA1区细胞凋亡率和Bcl-2、Bax、p53、Fas的蛋白表达。结果

2、 治疗组大鼠脑组织中凋亡细胞数低于缺血再灌注组，Bcl-2的表达明显高于缺血再灌注组，Bax、p53、Fas的表达低于对照组（P<0.05）。结论 纳洛酮可能通过促进Bcl-2的表达和抑制Bax、p53、Fas的表达来减少脑复苏后神经细胞的凋亡而发挥其脑保护的作用。 【关键词】 脑复苏；纳洛酮；凋亡；基因Experimental study of naloxone on rat cellular apoptosis and the mechanism of genic regulation after brain resuscitationAbstract Objective To ob

3、serve the effects of naloxone on rat cellular apoptosis and the expression of the relevant regulatoty genes after brain resuscitation and to explore the molecular mechanism of naloxone on neuro protection.Methods The rats were pided into three groups:the dummy operative group，the simple ischemia-rep

4、erfusion.To detect the cellular apoptosis and the protein expression of Bcl-2，Bax，p53 and Fas.Results The number of cell apoptosis in the treatment group was lower than that in ischemia-reperfusion group，and the expression of Bcl-2 was significantly higher than that in ischemia-reperfusion group.And

5、 the expressions of Bax，p53 and Fas in the treatment group were lower than those in the contrast group.Conclusion Naloxone can play an role in the protection of brain through diminishing neurocyte apoptosis by promoting the expression of Bcl-2 and restraining the expression 欢迎您访问纳洛酮对大鼠脑复苏后细胞凋亡基因调控机制

6、的实验研究 of Bax，p53 and Fas.Key words brain resuscition;naloxone;apoptosis gene大量临床研究已证实纳洛酮的脑保护作用，但其脑保护的机制目前尚未完全阐明。近年研究已显示，脑复苏后存在细胞凋亡及其相关基因的表达改变。有关纳洛酮对脑复苏后细胞凋亡及其相关蛋白表达影响的研究，国内、外报道不多。本实验采用TUNEL法及免疫组化法，分别观察纳洛酮对大鼠脑复苏后海马CA1区细胞凋亡及调控凋亡的相关基因Bcl-2、Bax、p53、Fas蛋白表达的影响，从分子生物学角度进一步探讨纳洛酮的脑保护作用。1 材料与方法1.1 实验动物与分组 健康

7、Wistar大鼠120只雌雄不拘，体重（250±50）g，由华中科技大学同济医学院动物中心提供，将大鼠随机分成3组：假伤对照组（40只）、缺血10 min再灌注24 h组（40只） 及治疗组（40只），3组再分为凋亡细胞组、Bcl-2组、Bax组、p53组、Fas组，每一亚组各8只。1.2 脑缺血再灌注模型 脑缺血再灌注模型1方法建立大鼠急性全脑缺血再灌注模型。以6%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔内注射麻醉，在大鼠颈部背侧切开皮肤，暴露第一颈椎两侧翼小孔，电凝两侧椎动脉，局部缝合；24 h后，动物以乙醚麻醉后，作颈前切口，分离两侧颈总动脉，待动物清醒后，以微动脉夹夹闭两侧颈总动

8、脉，用脑电图检测脑电波，出现静息脑电波为全脑缺血，否则弃之。10 min后松开动脉夹，再灌注24 h，缝合皮肤切口。假手术组只分离第一颈椎两侧翼小孔，但不电凝两侧椎动脉，只分离两侧颈总动脉，但不夹闭之。实验中保持大鼠体温（37±0.5），未昏迷或缺血后有癫痫、抽搐等并发症大鼠均放弃。治疗组于夹闭前10 min腹腔注射盐酸纳洛酮5 mg/kg（北京四环制药厂生产），后每隔4 h等量注射一次。假手术组和对照组于相同的时间点分别予等量的生理盐水。1.3 标本采取和组织切片制备 所有Wistar大鼠脑缺血10 min再灌注后24 h，用40 g/L多聚甲醛经心脏灌注后断头取脑，于前囟以美蓝标

9、记，冠状切取由前向后25 mm组织块，固定、脱水、透明石蜡包埋，连续冠状切片，片厚4 m。1.4 指标检测 采用TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡细胞。采用SP法进行Bcl-2、Bax、p53、Fas的免疫组织化学染色。在光学显微镜下观察TUNEL及Bcl-2、Bax、p53、Fas的免疫反应结果，并计数，计算平均阳性率。1.5 统计学方法 所有数据均以SPSS 10.0 for统计软件包进行数据统计处理，采用的统计方法为2检验。2 结果2.1 脑复苏后海马CA1区TUNEL阳性细胞计数 如表1所示，对照组、治疗组TUNEL阳性细胞较假手术组明显增加，二者与假手术组之间差异均有统计学意义（

10、P<0.05）；同时，治疗组TUNEL阳性细胞较对照组明显减少，两组之间亦存在显著差异（P<0.05）。2.2 Bcl-2蛋白在各组的阳性率表达 与假手术组比较，Bcl-2蛋白在对照组、治疗组大鼠中均有明显的阳性表达，二者与假手术组之间差异均有统计学意义（P<0.05）；但在治疗组较对照组明显增多，两组之间差异有统计学意义（P<0.05），见表1。2.3 Bax蛋白在各组的阳性率表达 Bax蛋白在对照组大鼠中有明显的阳性表达，分别与假手术组、治疗组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；虽其阳性表达在治疗组较假手术组为低，但两组之间差异无统计学意义，见表1。2.4

11、 p53蛋白在各组的阳性率表达 与假手术组比较，p53蛋白在对照组、治疗组大鼠中均有明显的阳性表达，二者与假手术组之间差异有统计学意义（P<0.05）；但在对照组较治疗组明显增多，两组之间差异有统计学意义（P<0.05），见表1。2.5 Fas蛋白在各组的阳性率表达 与假手术组比较，Fas蛋白在对照组、治疗组大鼠中均有明显的阳性表达，二者与假手术组之间差异有统计学意义（P<0.05）；但在对照组较治疗组明显增多，两组之间差异有统计学意义（P<0.05），见表1。表1 脑复苏后细胞凋亡相关基因蛋白阳性率表达注：治疗组与对照组比较，*P<0.05；两组分别与假手术组比

12、较，P<0.053 讨论研究证实，心肺脑复苏后细胞凋亡参与了继发性脑损害2。细胞凋亡是受基因调控的主动细胞死亡，许多基因如Bcl-2、C-myc、C-fos、Caspase 3、p53、Fas、Bax 等均参与细胞凋亡的发生。野生型p53主要通过诱导WAF1/CIP1基因的表达致细胞凋亡，又可通过下调Bcl-2和上调Bax，及增强CD95基因的表达促进细胞凋亡。作为肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体家庭成员之一的Fas具有诱导细胞凋亡的作用，Bcl-2的过表达可抑制其致细胞凋亡的作用。盐酸纳洛酮作为阿片受体竞争性拮抗剂，近年已被广泛应用于临床心肺脑复苏等急危病的抢救3。实验已证明阿片肽参

13、与脑缺血损伤的病理生理过程，纳洛酮可通过拮抗阿片肽的病理生理效应而起到脑保护作用4。内源性阿片肽刺激兴奋性氨基酸的大量释放，导致受体门控的Ca2+细胞内流，而已有实验研究证实纳洛酮可通过拮抗内源性阿片肽活性，减少全脑缺血再灌注后脑组织总钙水平，从而减少钙内流即抑制钙超载5，而Bcl-2抗细胞凋亡机制之一为抑制Ca2+释放。本实验研究结果显示，治疗组大鼠腹腔注射纳洛酮，TUNEL阳性细胞较对照组明显减少，差异有统计学意义（P0.05）。表明纳洛酮可减少心肺脑复苏后神经细胞的凋亡，具有脑保护的作用。同时，在本实验的研究中，治疗组大鼠Bcl-2表达阳性细胞数表达明显高于对照组（P0.05），p53、

14、Fas阳性细胞数表达则明显低于对照组（P0.05），虽然Bax阳性细胞数表达在手术组和治疗组之间无差异，但数量在治疗组是减少的，提示纳洛酮的脑保护作用与下调p53、Fas、Bax蛋白的表达和上调Bcl-2蛋白的表达有关，研究发现，阿片的过度激活可明显上调促凋亡基因Bax的表达，而抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而促进凋亡的作用6，7。纳洛酮作为阿片受体竞争性拮抗剂，可能通过抑制阿片类物质的促凋亡作用，以达到减少神经细胞凋亡的作用，这其中可能就通过下调p53、Fas、Bax蛋白的表达和上调Bcl-2蛋白的表达，重新调整了调控基因网络的平衡而起到了脑保护作用。综上所述，脑复苏后细胞凋亡调控基因表达失调，诱发神经细胞凋亡，进一步加重脑损伤程度；纳洛酮干预后，可改变脑复苏后