试论NBQX对脑缺血再灌注后成年大鼠大脑少突胶质前体细胞的保护作用

1、试论NBQX对脑缺血再灌注后成年大鼠大脑少突胶质前体细胞的保护作用              作者：李华杰 吴 坚 盛世英 朱林凤 张菊美【摘要】  目的 探讨脑缺血再灌注后成年大鼠大脑少突胶质前体细胞的变化及MK801和NBQX对其保护作用。方法 以线栓法制作成年SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型(阻塞90min再灌注1d、7d和14d)，分别向其大脑皮质缺血区立体定向注射5mmol/L 的MK801和50 mmol/L的NBQX各1l，用免疫荧光组织化学法检测脑缺血

2、再灌注后成年大鼠早期大脑梗死中心区、梗死周边区和缺血对侧NG2和O4阳性细胞数量。结果 脑缺血再灌注后成年大鼠大脑皮质梗死中心区NG2 和O4阳性细胞逐渐减少， NBQX组大鼠NG2和O4阳性细胞数减少的幅度较少。脑缺血再灌注后梗死周边区NG2和O4阳性细胞数逐渐增加，NBQX组大鼠增加更明显，而MK801组与生理盐水组无明显差别。结论 成年SD大鼠脑缺血再灌注后梗死周边区少突胶质前体细胞增多。NBQX对少突胶质前体细胞早期的缺血性损伤有保护作用。 【关键词】  缺血;再灌注;少突胶质前体细胞;NBQX【Abstract】 Objective To explore the chang

3、e of oligodendrocyte precursor cells in adult rats after focal cerebral ischemia and the protection of MK801 and NBQX to them. Methods Focal cerebral ischemia and reperfusion model in male adult SD rats was established by occluding the right middle artery with 40 nylon thread (blood flow blocked for

4、 90 minutes and then reperfusion for 1 day, 7 days and 14 days.One microliter MK801 (5mmol/L) and NBQX (50mmol/L) were respectively injected into the cerebral ischemic area of SD rats under stereodirectional instrument right after ischemia.Then NG2,O4 positive cells in the ischemic core, ischemic pe

5、numbra and contralateral area of rats were determinated at each timepoint after reperfusion by immunofluorescence histochemistry. Results The number of NG2 , O4 positive cells within the ischemic core decreased significantly at each timepoint with the NBQX group in less amount. The number of NG2 and

6、 O4positive cells within ischemic penumbra increased gradually after reperfusion with the NBQX group in higher amount. Conclusion The marked increase of oligodendrocyte precursor cells is observed in the periinfarct area during the postischemic reperfusion period in the adult rat brain. And NBQX has

7、 some neuroprotective effect to oligodendrocyte precursor cells in postischemic brain injury.【Key words】 Ischemia; Reperfusion; Oligodendrocyte precursor cells; NBQX兴奋性氨基酸毒性损伤作用是脑创伤和脑卒中等中枢神经系统(central nervous system，CNS)疾病中神经元死亡的主要因素之一1。而少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPC)膜上含有大量的兴奋性氨基酸受体。

8、MK801和NBQX分别是N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)受体和氨基3羟基5甲基4异唑丙酸盐(alphaamino3hydroxy5methyl4isoxazole propionate，AMPA)受体的拮抗剂。我们观察了脑定向注射MK801和NBQX对大鼠脑缺血再灌注后早期大脑皮质NG2和O4表达的影响，报道如下。1 材料和方法1.1 动物和分组 成熟雄性SD大鼠(苏州大学实验动物中心提供)280320g，共60只，随机分为正常对照组(缺血前)、生理盐水组、MK801组和NBQX组，缺血再灌注后1d、7d及14d共10个小组，每组6只大鼠。1.2 动物模型制作

9、 大鼠脑缺血再灌注损伤模型制作参照Kitagawa H的方法，用40的无创单股尼龙手术线由近端向远端插入颈总动脉、颈内动脉，至大脑中动脉起始段，由此造成大鼠局灶性脑缺血，于90min后拔除尼龙线，开始再灌注。对照组麻醉后分离出右侧颈总动脉，然后缝合。麻醉及手术期间使大鼠肛温保持在3737.5。大鼠清醒后具备以下表现者为动物模型制作成功，记入实验组：大鼠朝左侧转圈爬行，或者左前肢无力并向左侧方爬行。NBQX组和MK801组大鼠脑缺血后即刻在KOPF TAXIC500900型立体定位仪下分别向其脑内缺血区注射NBQX(50 mmol/L)和MK801(5mmol/L)各1l，注射速度0.2 l/m

10、in。生理盐水组大鼠依照上述方式注射1l生理盐水。1.3 组织标本制备 用3.6%水合氯醛腹腔注射将大鼠麻醉后，经主动脉先后灌注4的生理盐水和4%多聚甲醛300ml，然后断头取脑，4%多聚甲醛室温下固定2h，30%蔗糖溶液过夜，用冰冻切片机连续冠状切取10m厚切片。1.4 NG2、O4检测 采用免疫荧光组织化学间接法，先后加一抗，小鼠抗大鼠NG2 IgG、小鼠抗大鼠O4 IgM，二抗，兔抗小鼠IgG+MFITC(华美生物工程公司)，然后在荧光显微镜下观察NG2、O4阳性细胞形态并计数。1.5 NG2、O4阳性细胞计数 将缺血再灌注的冠状面前囟处脑组织浸入2%氯化2,3,5三苯基四氮唑(TTC)

11、溶液中，37避光孵育30min，如图1所示，图中所示的梗死中心区(a)、梗死周围区(b)及梗死对侧区(c)随机选取5个200倍视野，记录NG2、O4阳性细胞的数量，每只大鼠选取三张连续切片，计算每只大鼠NG2、O4阳性细胞算术平均数，以个/视野表示。1.6 统计学分析 所有资料均用±s表示，均数比较采用方差检验，以P0.05为差异有统计学意义。          2 结果2.1 NG2、O4阳性细胞形态及分布特点 正常对照组大鼠大脑皮质分布数目较多的NG2、O4阳性细胞，另外，胼胝体和皮质下白质等其他区域

12、也有较多的NG2、O4阳性细胞。NG2表达在OPC的细胞膜上，NG2阳性细胞荧光显微镜下呈黄绿色，形态较小，直径20m左右，呈圆形、椭圆形或梭形(图2);O4也位于未成熟少突胶质细胞膜上，O4阳性细胞体积比NG2阳性细胞略大，形态呈圆形或椭圆形(图3)。2.2 梗死中心区NG2、O4阳性细胞数变化 在200倍显微镜视野下，各组大鼠大脑梗死中心区每视野内NG2、O4阳性细胞平均数见表1。脑缺血再灌注后成年大鼠大脑皮质梗死中心区NG2 和O4阳性细胞逐渐减少， NBQX组大鼠NG2和O4阳性细胞数减少的幅度较少。2.3 梗死周围区NG2、O4阳性细胞数变化 在200倍显微镜视野下，各组大鼠大脑梗死

13、周围区每视野内NG2、O4阳性细胞平均数见表2。脑缺血再灌注后梗死周边区NG2和O4阳性细胞数逐渐增加，NBQX组大鼠增加更明显，而MK801组与生理盐水组无明显差别。3 讨论OPC泛指从少突胶质祖细胞到未成熟少突胶质细胞之间的一系列细胞，这是一个连续的过程。成年动物脑内的少突胶质前体细胞占所有神经细胞的5%8%，在人脑中所占的比例还要大。近年来研究发现，少突胶质细胞对缺血缺氧等刺激同样敏感，尤其是其前体细胞，脑缺血再灌注引起的能量耗竭、氧化应激同样会损伤少突胶质前体细胞。NG2是表达在少突胶质祖细胞膜上的一个糖蛋白，是少突胶质祖细胞的特异性细胞标志物;O4是表达在未成熟少突胶质细胞膜上的一个

14、脂质抗原，是未成熟少突胶质细胞的细胞标志物。本研究结果显示，脑缺血再灌注后早期成年大鼠大脑皮质梗死中心区NG2和O4阳性细胞数逐渐减少，且非常显着，可能是脑缺血再灌注后产生的细胞因子、自由基以及过多的兴奋性氨基酸使得表达髓鞘蛋白基因的少突胶质细胞死亡或凋亡而减少2，5。OPC细胞膜上有较多的兴奋性氨基酸受体，主要为非NMDA受体，包括AMPA受体和红藻氨酸受体。脑缺血以后,由于神经细胞损伤使得兴奋性氨基酸释放增加，细胞外积聚了大量的兴奋性氨基酸，使得兴奋性氨基酸受体过度兴奋，兴奋性氨基酸受体的过度兴奋是引起少突胶质前体细胞损伤的重要途径1。MK801和NBQX分别是NMDA受体和AMPA受体的

15、拮抗剂，二者都有较好的水溶性，定向注射到脑内后能很快扩散到周围脑组织，浓度分别为5mmol/L和50mmol/L的MK801和NBQX在脑内能充分的阻断NMDA受体和AMPA受体2，6。研究显示，注射浓度分别150mmol/L和50mmol/L的NBQX和MK801不会引起注射部位局部非特异性损伤。本研究结果显示，NBQX组大鼠梗死中心区和梗死周边区的NG2和O4阳性细胞数都多于MK801组和生理盐水组，提示脑缺血再灌注后细胞间隙兴奋性氨基酸增多，OPC膜上的AMPA受体介导了兴奋性氨基酸毒性损伤，而NBQX恰恰阻断了这一途径，减轻了对OPC的缺血性损伤，引起NBQX组NG2和O4阳性细胞数相

16、对增多。因此，兴奋性氨基酸可能参与了OPC缺血后的损伤过程，运用兴奋性氨基酸受体拮抗剂可能是缺血性脑损伤的脑保护途径之一。表1 梗死中心区NG2 、O4阳性细胞数比较 与生理盐水组比较，*P0.05;与MK801组比较，#P0.05表2 梗死周边区NG2 、O4阳性细胞数比较与生理盐水组比较，*P0.05;与MK801组比较，#P0.05【参考文献】  1 许绍芬主编. 神经生物学M. 上海：上海医科大学出版社，1999：202209. McDonald JW, Althomsons SP, Hyrc KL, et al. Oligodendrocyte from forebrain

17、 are highly vulnerable to AMPA/kainate receptormediated excitotoxicityJ. Nat Med, 1998, 4(3):291297. Kitagawa H, Sasaki C, Sakai K, et al. Adenovirusmediated gene transfer of glial cell linederived neurotrophic factor prevents ischemic brain injury after transient middle cerebral artery occlusion in

18、 ratsJ.J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(6): 1336. Baumann N, Dinh DP. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous systemJ.Physiol Rev, 2001, 81:871927. Dewar D, Underhill SM, Goldberg MP. Oligodendrocytes and ischemic brain injuryJ.J Cereb Blood Flow Metab，2003，23(3):263. Massieu L, Tapia R. 2,3Dihydroxy6nitro7sulfamoylbenzo