部分红麻MYB转录因子基因序列的生物信息学分析

1、论文题目:部分红麻MYB转录因子基因序列的生物信息学分析学院:生命科学学院专业年级:生物技术2011级学号:3115405030姓名:陈志超指导教师、职称:徐建堂副研究员2015年5 月5 日Bioinformatics analysis on part of MYB transcription factor in Kenaf (Hibiscus cannabinus L.Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Bachelor in School of Life Sciences, FAFU

2、College:School of Life SciencesSpeciality:BiotechnologyEntrance year:2011I.D. No.: 3115405030Candidate: Chen ZhichaoSupervisor: Associate Prof. XU JiantangSubmitted: In May, 2015目录摘要 (1英文摘要 (11引言 (11.1研究意义 (11.2前人研究进展 (21.3本研究切入点 (31.4拟解决关键性问题 (32材料与方法 (32.1 试验材料 (32.2 总DNA提取 (42.3 目的基因的克隆与生物信息学分析 (

3、42.4 PCR扩增 (43结果与分析 (53.1红麻DNA提取结果 (53.2红麻MYB的PCR结果 (63.3 PCR产物测序结果(铂尚测序公司 (73.4 DNAMAN比对结果 (73.5进化树 (123.6 ORF分析 (134讨论 (154.1 DNA提取与目的片段扩增 (154.2 关于目的片段引物设计 (154.3转录组测序结果验证 (165结论 (16参考文献 (16致谢 (18部分红麻MYB转录因子基因序列的生物信息学分析陈志超福建农林大学,生命科学学院,生物技术2011级摘要:通过对红麻MYB相关转录因子进行序列验证分析,为下一步开展MYB基因全长克隆奠定基础。对红麻MYB

4、转录组数据分析,从中筛选出92条与MYB相关序列,进行进化树分析。从红麻转录组中随机挑选8条MYB基因,利用Oligo7 软件设计特异引物,以红麻品种福红7号基因组总DNA 为模板进行中间片段扩增与扩增产物测序,利用DNAMAN8软件及NCBI Blast进行序列比对分析。其中7条MYB 相关因子的基因序列相似度达99%以上,经分析后均能获得转录组序列的开放阅读框。获得基于转录测序的7条MYB转录因子相关序列中间片段,为下一步开展MYB基因全长克隆及功能验证奠定良好基础。关键词:红麻,MYB转录因子,转录组,基因克隆,比对分析Bioinformatics analysis on part of

5、 MYB transcription factor in Kenaf(Hibiscus cannabinus L.Chen zhichao, Fujian Agriculture and Forestry University, college of life science, Department of Biotechnology , Major of Biotechnology , Grade 2011, No.3115405030Abstract: Based on kenaf MYB related transcription factor sequence analysis, to

6、provide a basis for kenaf MYB gene cloning. Through the a nalysis of Kenaf transcriptome data, a total of 92 MYB transcription factor related sequence were selected from the data, and then analysis its phylogenetic tree.Eight kenaf MYB gene sequences were randomly selected from the data, using softw

7、are oligo7 to design specific primer s, with total genomic DNA of Varieties Fuhong No.7 as the template for the middle fragment, sequence alignment analysis using DNAMAN 8 software and NCBI Blast. Almond them there were seven sequences similarity were up to 99%, and both of them exist the transcript

8、ome sequence of the open reading frame. Obtained based on the transcription of sequencing seven MYB transcription factors related sequence fragment, the results could lay a good foundation for cloning and functional verification of MYB gene.Key words: Kenaf ;MYB Transcription factor; Gene cloning;Bl

9、ast1引言1.1研究意义20世纪以来,由于生态环境恶化,各国政府及科研机构都十分重视生态环境的修复和植物抗逆性育种的研究,而发掘和利用植物抗逆性有利基因,培育逆境条件下能保持相对稳定的产量和品质的新品种,是抗逆性育种的重要目标1。红麻(Hibiscus cannabinus L.是耐旱、耐盐碱、适应性高、抗逆性强的韧皮纤维作物,广泛开发利用于麻纺、板材、造纸、可降解地膜、生产动物饲料、食用和药用等领域2。MYB 类转录因子是一类含MYB 结构域的转录因子,其命名源于禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类(v-myb avian myeloblastosis viral oncogenehomolo

10、g, MYB,其共有的特征具是有高度保守的MYB DNA 结合结构域。动物MYB 类转录因子的DNA 结合结构域通常含有3 个5053 个氨基酸的不完全重复区,对应称为之R1、R2 和R3 区,每个MYB 区域中一般都含有3 个起着疏水核心的作用的保守的色氨酸残基,可折叠成一个螺旋-转角-螺旋的结构,是与目标DNA的大沟结合的结构基础3。植物MYB 类转录因子可简单地分成3 个亚类:R1-MYB、R2R3-MYB 和R1R2R3-MYB,其主要成员是含2个MYB 结构域的MYB 蛋白4,转录因子作为上游的调控因子可对下游相关功能基因的表达进行调控。前人研究表明:植物MYB 转录因子家族在植物生

11、长发育的全过程中发挥重要作用,其广泛参与植物的次生代谢调控、木质素和纤维素的合成调控、对激素和逆境胁迫的应答5-7,并且在细胞分化、形态建成和光信号传导等方面起到重要的调控作用8-11。但部分研究表明,并非所有的MYB 相关蛋白都是转录激活子,也有部分起负调控作用,抑制目标基因的表达4。利用转录因子对作物的抗逆性、抗病性进行改良比单纯使用下游的某种功能基因改良作物抗逆性、抗病性,获得的综合效果更为理想12。目前尚未发现有关红麻MYB研究的报道,本研究为红麻MYB基因全长克隆及功能验证奠定良好基础,从而为改良红麻品种,培育抗病、抗逆红麻做好前期工作。1.2前人研究进展最早克隆得到的植物MYB 转

12、录因子是玉米的C1 基因13。随着现代生物技术的迅猛发展,人们对转录调控研究的逐渐重视,获得的各植物MYB 相关基因的数量也迅速增加,对其功能的研究也更加深入。目前已经从各种植物中鉴定出了丰富的MYB 转录因子家族基因,如拟南芥中MYB 成员约有130个,玉米中约有100 个14, 15。Dai 等(2007将水稻OsMYB3R-2 基因在拟南芥(Arabidopsis thaliana中过量表达,发现转基因拟南芥提高了对干旱、盐、低温和ABA 胁迫的耐受力16。甘蔗R2R3-MYB 类似基因Sc2RMyb1基因的表达受H2O2和NaCl 抑制而下调,推测该基因作为负调节因子参与了NaCl 胁

13、迫应答相关基因的调控过程11。从苹果中分离鉴定的MdMYB1 能在拟南芥和离体培养的葡萄体细胞中异位表达合成花青素苷,并且发现MdMYB1 的启动子区具有丰富的多态性17。2008 年,有研究发现文心兰(Oncidium hybrid中的OgMYB1 和葡萄中的VlmybA1-3 转录因子都跟花器官或果皮着色有着紧密联系18, 19。通过比较正常供水和干旱胁迫条件下叶片的差异蛋白质点,揭示出红麻GA42 表现出较强的耐旱性与6 个差异表达蛋白质点的上调表达有关,分别为2 个Rubisco 或其大亚基、1 个推定的胞质型谷氨酰胺合成酶、1 个二甲基萘醌甲基转移酶、1 个Rubisco 活化酶和1

14、 个ATP 合酶 亚基1。1.3本研究切入点蛋白质直接参与生物体内生理生化反应,与性状有直接联系20,而蛋白质由基因表达,即基因直接或间接控制性状,为进一步研究红麻的抗病、抗逆基因从而改良红麻品种,有必要在基因组水平上进行研究,对转录组序列进行验证分析将为红麻MYB基因全长克隆及功能验证提供重要的参考价值。1.4拟解决关键性问题本研究应用生物信息学方法与技术,对红麻MYB转录组序列进行验证分析,验证转录组序列的正确性,为进一步进行红麻MYB基因全长克隆与功能验证奠定良好基础,从而为红麻改良品种,选育优良性状红麻做好前期工作。2材料与方法2.1 试验材料以福建农林大学作物遗传改良实验室筛选鉴定的

15、红麻品种福红7号为材料,播种于玻璃温室大型陶瓷盆中,正常栽培管理,长出苗后每盆各留苗10 株,最后定苗为5 株。试验于2014 年在福建农林大学作物遗传改良田间实验室和福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室进行。 图1红麻赞引1号 图2红麻福红7号2.2 总DNA 提取本研究分别采用CTAB (4% 法21, 22以及Bioteke 试剂盒法提取红麻叶片的基因组总DNA 。将提取的DNA 放置于20冰箱保存备用。2.3 目的基因的克隆与生物信息学分析2.4 PCR 扩增反应体积为20L ,反应体系如下:2×Power Taq Master PCRmix 10LForwar

16、d Primer 1LReverse Primer 1LDNA 1LAdd ddH2O to a final volume of 20 µL引物对KFMYB-1R/ KFMYB-1F、KFMYB-2R/ KFMYB-2F和KFMYB-3R/ KFMYB-F、KFMYB-4R/ KFMYB-4F、KFMYB-5R/ KFMYB-5F、KFMYB-6R/ KFMYB-6F、KFMYB-7R/ KFMYB-7F、KFMYB-8R/ KFMYB-8F分别加入各自的PCR反应管中,反应在PCR仪(ABI 梯度PCR仪(型号Veriti上进行,热循环条件为:stage1:预热95 5 min;s

17、tage2:变性9545s,退火(5056 45 s,延伸721min,35个循环;stage3:延伸7210min;4保存。取PCR产物5 µL,用1.2%的琼脂糖电泳检测,用凝胶成像仪(培清JS-2012自动对焦凝胶成像分析仪拍摄电泳图片。(注:kenaf(红麻简写为“KF”3结果与分析3.1红麻DNA提取结果 图3红麻DNA凝胶电泳检测通过比较分析,虽然传统CTAB法提取的DNA也可用于PCR扩增,但操作过程复杂、提取效率低。因此,本研究采用提取效果较好植物基因组DNA试剂盒进行DNA提取,从而提高实验效率。结果如图3红麻DNA凝胶电泳检测图(试剂盒提取所示。3.2红麻MYB的

18、PCR结果为得到最佳退火温度,首先对每对引物设置50-56退火温度梯度,通过1.2%琼脂糖检测,结果如图4、5所示。从图上可知,除第5对引物外,其他引物均能得到条带整齐清晰的目的条带,大小与预测片段大小基本一致,说明所设计的特异引物可用于红麻MYB转录因子基因序列中间片段的扩增,为进行下一步实验打下良好基础。 图4红麻MYB引物1-4PCR产物凝胶电泳图4中:M为DL2000marker;16为红麻MYB引物1,对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56;712为红麻MYB引物2,对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56; 1318为红麻MYB引物3,对应的退火温度分

19、别为50,52,53,54,55,56;1924为红麻MYB 引物4,对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56。 图5红麻MYB引物5-8PCR产物凝胶电泳图5中:M为DL2000marker;16为红麻MYB引物5,对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56;712为红麻MYB引物6,对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56; 1318为红麻MYB引物7,对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56;1924为红麻MYB 引物8,对应的退火温度分别为50,52,53,54,55,56。3.3 PCR产物测序结果(铂尚测序公司表1:红麻PCR产

20、物测序结果订单号生产编号样品名称样品类型测序引物报告结果报告备注F12034 F120490a hongma-KFMYB-1 PCR未纯化KFMYB-1F_10P 成功F12034 F120490b hongma-KFMYB-1 PCR未纯化KFMYB-1R_10P 成功F12034 F120491a hongma-KFMYB-2 PCR未纯化KFMYB-2F_10P 成功F12034F120491b hongma-KFMYB-2PCR未纯化KFMYB-2R_10P成功poly后双峰F12034 F120492a hongma-KFMYB-3 PCR未纯化KFMYB-3F_10P 成功F120

21、34 F120492b hongma-KFMYB-3 PCR未纯化KFMYB-3R_10P 成功F12034 F120493a hongma-KFMYB-4 PCR未纯化KFMYB-4F_10P 成功F12034 F120493b hongma-KFMYB-4 PCR未纯化KFMYB-4R_10P 成功F12034 F120494a hongma-KFMYB-5 PCR未纯化KFMYB-5F_10P 成功双峰F12034 F120494b hongma-KFMYB-5 PCR未纯化KFMYB-5R_10P 成功双峰F12034 F120495a hongma-KFMYB-6 PCR未纯化KFM

22、YB-6F_10P 成功F12034 F120495b hongma-KFMYB-6 PCR未纯化KFMYB-6R_10P 成功F12034 F120496a hongma-KFMYB-7 PCR未纯化KFMYB-7F_10P 成功后双峰F12034 F120496b hongma-KFMYB-7 PCR未纯化KFMYB-7R_10P 成功后双峰F12034F120497a hongma-KFMYB-8PCR未纯化KFMYB-8F_10P成功F12034F120497b hongma-KFMYB-8PCR未纯化KFMYB-8R_10P成功表1为铂尚测序公司对本研究提供的PCR产物的测序结果3.

23、4 DNAMAN比对结果将通过特异引物得到的PCR产物测序得到的碱基序列与转录组测序结果进行比对分析后可知,第1对和第4对引物测序结果与转录组测序结果完全一致。但其他几对引物扩增所获得的碱基序列存在单核苷酸突变、片段变异等情况。这可能是由于转录组测序时,所用的研究材料为赞引1号(来自非洲赞比亚,而本研究所用的材料为福红7号(福建农林大学选育,其品种之间基因组存在差异所致。比对结果如下: 图6利用DNAMAN 8软件比对红麻MYB基因(KFMYB-1测序结果图6为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果,其中:KF-1A为红麻MYB引物1转录组原序列,KF-1B为红

24、麻MYB引物1的PCR产物测序结果序列。其覆盖率达到85%,相似度为100%,说明测序效果良好,为验证转录组序列提供重要参考依据。 图7利用DNAMAN 8软件比对红麻MYB基因(KFMYB-2测序结果图7为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果,其中:KF-2A为红麻MYB引物2转录组原序列,KF-2B为红麻MYB引物2的PCR产物测序结果序列。其覆盖率达到62%,相似度为100%,说明测序效果良好,为验证转录组序列提供重要参考依据。 图8 利用DNAMAN 8软件比对红麻MYB基因(KFMYB-3测序结果图8为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序

25、结果序列进行比对的结果,其中:KF-3A为红麻MYB引物3转录组原序列,KF-3B为红麻MYB引物3的PCR产物测序结果序列。其覆盖率达到69%,相似度为99%,其中有6对碱基发生突变,说明测序效果良好,为验证转录组序列提供重要参考依据。 图9利用DNAMAN 8软件比对红麻MYB基因(KFMYB-4测序结果图9为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果,其中:KF-4A为红麻MYB引物4转录组原序列,KF-4B为红麻MYB引物4的PCR产物测序结果序列。其覆盖率达到63%,相似度为100%,说明测序效果良好,为验证转录组序列提供重要参考依据。 图10利用DNAM

26、AN 8软件比对红麻MYB基因(KFMYB-5测序结果图10为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果,其中:KF-5A为红麻MYB引物5转录组原序列,KF-5B为红麻MYB引物5的PCR产物测序结果序列。比对不出结果,还有待于进一步研究。 图11利用DNAMAN 8软件比对红麻MYB基因(KFMYB-6测序结果图11为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果,其中:KF-6A为红麻MYB引物6转录组原序列,KF-6B为红麻MYB引物6的PCR产物测序结果序列。其覆盖率达到72%,相似度为100%,说明测序效果良好,为验证转录组序列提

27、供重要参考依据。 图12利用DNAMAN 8软件比对红麻MYB基因(KFMYB-7测序结果图12为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果,其中:KF-7A为红麻MYB引物7转录组原序列,KF-7B为红麻MYB引物7的PCR产物测序结果序列。其覆盖率达到63%,相似度为99%,说明测序效果良好,为验证转录组序列提供重要参考依据。 图13利用DNAMAN 8软件比对红麻MYB基因(KFMYB-8测序结果图13为利用DNAMAN8对转录组原序列和PCR产物测序结果序列进行比对的结果,其中:KF-8A为红麻MYB引物8转录组原序列,KF-8B为红麻MYB引物8的PCR产

28、物测序结果序列。其覆盖率达到65%,相似度为99%,其中由1对碱基发生突变,说明测序效果良好,为验证转录组序列提供重要参考依据。3.5进化树 图14红麻MYB转录因子进化分析(无自展值 图15红麻MYB转录因子进化分析(有自展值Kenaf进化树分析方法:1.将提供的106条MYB序列进行结构域预测,筛选包含有两个MYB-DNA-binding domain 的序列,e值小于-10的10条序列来做进化分析2.从plantTFDB数据库中下载了大豆,水稻,玉米,拟南芥的MYB序列(这些序列都包含有两个两个MYB-DNA-binding domain3.将筛选到的10条序列与下载的大豆,水稻,玉米,

29、拟南芥的MYB序列进行多序列比对,使用mega6.0软件,NJ(邻近法构建进化树(p-distence,bootstrap:10003.6 ORF分析表2 PCR产物测序序列ORF及其推导的氨基酸序列(*表示终止子 续表2 PCR产物测序序列ORF及其推导的氨基酸序列(*表示终止子 通过NCBI ORF Finder分析,8条PCR产物测序序列中的7条序列中均包含转录组测序序列的开放阅读框,验证了转录组序列的正确性。4讨论4.1 DNA提取与目的片段扩增转录组测序使用的DNA为红麻赞引1号的DNA,本研究的PCR使用的DNA为红麻福红7号的DNA,在对转录组序列与PCR产物测序序列进行比对时,

30、发现少数碱基变异,说明不同品种的红麻之间存在微小差异。4.2 关于目的片段引物设计本研究所用的引物使用Oligo7软件设计,引物长度为1827bp,GC含量为40%60%, Tm值为72左右,退火温度为55左右,设计的8对引物通过PCR扩增的产物均能得到清晰的条带,且其中7条能验证转录组测序序列,由结果可知,这样设计引物效果良好。4.3转录组测序结果验证由PCR产物测序所得序列与转录组测序序列通过DNAMAN8比对及NCBI Blast比对,所测得的8条序列中有7条能验证转录组测序序列,通过ORF分析,7条序列中均包含转录组测序序列的开放阅读框,说明转录组序列的正确性,为下一步基因全长克隆及功

31、能验证奠定良好基础。5结论通过转录组测序获得92条MYB转录因子相关序列,从中随机选出8条进行序列验证分析,其中7条相似度达99%以上,成功率达87.5%,均能获得转录组测序序列的开放阅读框,能够正确验证转录组测序的序列,为下一步开展MYB基因全长克隆与功能验证奠定良好基础。参考文献1. 祁建民, 姜海青, 陈美霞, 徐建堂, 马红勃, 方平平, 林荔辉, 陶爱芬, 陈伟: 干旱胁迫下红麻叶片的差异蛋白表达分析. 中国农业科学2012(17:3632-3638.2. 方平平, 祁建民, 粟建光, 张广庆, 林荔辉: 世界黄麻红麻生产概况与发展前景. 中国麻业科学2009(03:215-219.

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