柑桔黄龙病菌通用实时荧光PCR检测方法

1、DB/T ××××××××185四川省质量技术监督局 发布2006-08-15实施2006-08-04发布小麦蚜虫抗药性测定技术规范The technical rule for mornitoring resistance of wheat aphis to insecticidesDB51/T 6112006DB51四川省地方标准ICS备案号：1DB51/T 6112006目 次1 主要内容与适用范围1872 规范性引用文件1873 术语和定义1874 仪器设备1875 实验设计方法1886 试虫的标准化1887

2、 药剂的标准化1888 药剂处理方法1899 数据统计分析方法18910 抗药性水平确定19011 建立数据库190附录A （资料性附录） 小麦蚜虫抗药性测定数据原始报表191I前 言本标准的附录A为资料性附录。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准由四川省农业厅植物保护站负责起草。本标准主要起草人：彭丽年、张中明、蒋 凡、岳利华、李伦、杨启洪。小麦蚜虫抗药性测定技术规范1 主要内容与适用范围本标准规定了小麦蚜虫抗药性测定技术、仪器设备、试验设计方法、试虫的标准化、药剂的标准化、药剂处理方法、数据统计分析方法、抗药性水平确定。 本标准适用于小麦蚜虫的抗药性测定

3、，适用于以触杀作用为主要作用方式的杀虫剂的抗药性测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 4285 农药安全使用标准GB/T 8321 农药合理使用准则NY/T 612-2002 小麦蚜虫测报调查规范FAO,1980,FAO Plant Production and Protection Paper 21,Recommended Methods for M

4、easurment of Pest Resistance to Pesticides3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 抗药性 (Insect resistance to insecticides)是指昆虫能忍受杀死正常种群大部分个体的杀虫剂药量的能力，并在种群中逐渐发展。3.2 点滴法 (Topical application)又称局部施药法，是一种用微量点滴器将药液滴于昆虫特定部位的定量处理方法。3.3 毒力 T(oxicity of insecticide)是指药剂损害生物体的能力，即药剂对靶标生物的毒性。是在严格实验控制条件下，药剂对生物毒性的量度指标，一般用反应中值如L

5、D50等表示。3.4 致死中量(LD50) (Median lethal dose)指在观察时间内，药剂杀死种群(供试目标昆虫)50%时所需要的药剂剂量(g/头或g/g)。3.5 敏感种群 (Susceptable populations)在未接触过某种药剂的地区采集或在室内经多代隔离饲养获得的群体。3.6 敏感基线 (Susceptable toxicity baseline)用敏感种群测得的对某种药剂的毒力曲线。4 仪器设备2恒温养虫室或光照培养箱毛细管微量点滴器：容积0.03L0.05L冰箱天平(万分之一)玻璃仪器：容量瓶(10mL、25mL、50mL)、称量瓶、移液管或加液器、烧杯、直

6、径5 cm塑料培养皿等。其它：毛笔、滤纸等。5 实验设计方法5.1 测定方法采用室内毒力测定的方法，比较种群敏感度。采用的反应中值是以死亡率为指标的致死中量(LD50)。5.2 浓度设计测定前根据资料先做预备实验，在16 84 的试虫死亡时的药量范围，按照等比或等差级数设置6个浓度梯度，使药量跨越中值的两侧。药量间的死亡百分率应比较均匀，如果差异太大，可不按等比或等差数列，抽去或插入适当的药量。在预备实验的基础上，做正式实验。 5.3 供试虫数及重复每个浓度设34次重复，每重复处理3040头蚜虫，共处理90160头蚜虫。6 试虫的标准化6.1 田间采虫方法采取对角线取样法。在小麦穗期随机选取1

7、0块未施药麦田，每块田对角线5点取样，每点采集100头无翅雌成蚜共采5000头带回室内饲养一代，备用。6.2 饲养条件恒温养虫室或光照培养箱。温度(T)：22 24 ；相对湿度(RH)：75 80 ；饲料：小麦叶片。6.3 虫态及性别无翅雌成蚜。7 药剂的标准化7.1 药剂质量分数90 。7.2 溶剂丙酮：A·R。7.3 药液配制7.3.1 配制方法 先将原药稀释为较低浓度的中间药液(母液)，然后再进一步配成不同药量的供试药液。母液配制：称取一定的原药(精确至0.0002 g)，置于容量瓶中，用溶剂溶解稀释至刻度定容，摇匀备用。供试药液配制：根据实验设计配制6个药液质量浓度，待用。7

8、.3.2 计算方法a)原药取用量X1 (g)按式(1)计算:X1=C×V×10-6.(1)P式中：X1原药取用量，单位g；C母液质量浓度，单位g/mL；V母液体积，单位mL；P原药质量分数，单位。b)供试药液质量浓度X2(g/mL)按式(2)计算:X2=C.(2)A式中：X2 供试药液质量浓度，单位g/mL；C 母液质量浓度，单位g/mL；A 稀释倍数。c)每头虫受药量X3(g/头)按式(3)计算：X3=V1× X2.(3)1000式中：X3 每头虫受药量，单位g/头；V1 点滴量，单位LX2供试药液质量浓度，单位g/mL8 药剂处理方法8.1 方法采用毛细管微量

9、点滴法。毛细管体积为0.03 L0.05 L。8.2 步骤选择健康无翅雌成蚜，用毛笔挑起放在滤纸上，每张放5头，用干净的毛细管微量点滴器将药液定量点滴在供试蚜虫腹部背面，点滴时毛细管应尽量贴近虫体再挤出液滴，先点滴对照丙酮液，再由低浓度向高浓度逐一点滴药液。用毛笔轻轻将点滴后的蚜虫扫入养虫盒内，加盖放好。8.3 观察将处理好的蚜虫置于温度(T)2225 ，相对湿度(RH)75%85%的条件下，5h后用手持放大镜(10倍)检查蚜虫死亡数。死亡判断标准是以毛笔轻触虫体，虫体完全不动即为死亡。如果对照死亡率大于10%，应重做。9 数据统计分析方法9.1 致死中量单位g /头。9.2 计算校正死亡率处

10、理组校正死亡率X4()、X5()用式(4)、式(5)计算：X4()Y1Y2 ×100(4)Y1 或：X5()Y3Y4 ×100(5)1Y4 式中:X4()、X5()处理组校正死亡率；Y1对照组存活率，单位为百分数(%)；Y2处理组存活率，单位为百分数(%)；Y3处理组死亡率，单位为百分数(%)；Y4对照组死亡率，单位为百分数(%)。9.3 求毒力回归方程和致死中量采用机率值分析法。采用抗药性统计数据处理及管理系统(简称IRM系统)统计计算，直接输入点滴量(L)、各组浓度(g /mL)、总虫数和死亡虫数，得出直线回归方程(LDp)、r 值、卡方值(X2)、LD50(g/头)、

11、LD95(g/头)、LD99(g/头)、标准误(SE)及LD50置信限(95)等。10 抗药性水平确定10.1 抗性指数抗药性的确定采用比较群体对药剂的敏感度(反应中值)的方法，求出抗性指数，按式(6)计算。小数点后保留一位数。X6 R .(6)S式中：X6 抗性指数；R 测定种群LD50值；S 敏感基线LD50值。10.2 抗性水平标准抗性指数15，为相对敏感；抗性指数5.110，为低抗水平；抗性10.140，为中抗水平；抗性指数40.1160，为高抗水平；抗性指数160，为极高抗水平。11 建立数据库建立小麦蚜虫抗药性监测数据库，将测定的所有原始数据及计算结果按时间、地点建立档案，长期保存。191附录A （资料性附录）小麦蚜虫抗药性测定数据原始报表No：试虫学名:存药方式:采虫地点:致死中量:采虫时间:测定时间:饲养代数:作物生育期:试虫虫态:稀释溶剂:寄主作物:观察时间:测前饲料: 饲养情况:测后饲料