植物超氧化物歧化酶的制备工艺研究

1、植物超氧化物歧化酶的制备工艺研究         作者：江红霞，季本华，朱素琴 【摘要】 目的优化植物超氧化物歧化酶（SOD）的制备工艺。方法用热变性沉淀、等电点沉淀，45%，90%硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析，冷冻浓缩干燥等方法，从黄瓜中制备SOD，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。用考马斯亮蓝G-250法测                

2、60;                  作者：江红霞，季本华，朱素琴【摘要】  目的优化植物超氧化物歧化酶（SOD）的制备工艺。方法用热变性沉淀、等电点沉淀，45%，90%硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析，冷冻浓缩干燥等方法，从黄瓜中制备SOD，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量，用NBT光还原法测定SOD活性。结果SOD酶比活为89.2381 U·mg-1，回

3、收率为18.41%，提纯倍数为11.02倍。结论该工艺简便高效地从植物中提纯超氧化物歧化酶，可用于生产实际。 【关键词】  超氧化物歧化酶； 制备工艺； SOD酶活力Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction technology of superoxide dismutase from plants. MethodsWe extracted SOD from the cucumber by heat treatment , isoelectric fraction, ammonium sulfate fractionation and

4、ion exchange chromatography, Coomassie brilliant blue G-250 was adopted to determine the content of the protein and NBT-reduction was used to measure the SOD activity. Meanwhile, the purified substance was identified as SOD by the polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and SOD activity staining.

5、ResultsSOD had a specific activity of 89.2381 U·mg-1. The yield rate was 18.41%, and the multiplication was as 11.02 times. ConclusionThe technology is an extraction technology of superoxide dismutase form plants simply and efficiently and it will be a good reference for the production.Key word

6、s：Superoxide dismutase(SOD)；  Extraction technology；  Activity of SOD    超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，作为一种专一清除生物体内超氧阴离子自由基(O2-·)的酶，催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，减少超氧阴离子自由基对生物体的毒害。目前，人们已从动物、植物和微生物体内分离得到，并且通过多种方法应用到实际中1，如应用到医药方面、食品、农业、化妆品及人和动植物许多疾病的监测方面等。    植物超氧化物

7、歧化酶的制备工艺，其主要目的是纯化植物中的SOD，最大限度地清除杂蛋白，因此，常用的方法主要有热变性法、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、超滤法、层析法等2。而本文主要探究超氧化物歧化酶的制备工艺，比较几种常用工艺，热变性法和等电点沉淀法简单，不需加其他试剂，但不能大幅度提高SOD的比活；盐析法有利于保持蛋白质的生理活性，但分辨率低3；离子交换层析主要用于高纯度的SOD精品的制备，处理量小。本研究将几种简单工艺相结合，扬长避短，找出一套既简便又能有效提高SOD纯化倍数的方法。1  材料与方法1.1 材料与试剂黄瓜；氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、甲硫氨酸、二乙基氨基乙基纤维素(DEA

8、E)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(国药集团化学试剂有限公司)、甲叉双丙烯酰胺(中国医药集团上海化学试剂公司)等化学试剂均为分析纯；标准蛋白采用上海生物化学试剂公司产的牛血清白蛋白；考马斯亮蓝G-250(上海化学试剂分装厂)。1.2 仪器722光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；DYY-2稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)；电热恒温水浴锅 JK-S26型(上海华联医疗器械有限公司)；高速冷冻离心机D-37520(Osterode Kendro Laboratory Products)；LGJ-10冷冻干燥机(军事医学科学院实验仪器厂研制，北京松源滑

9、行科技发展有限公司制造) ；HD-3紫外检测仪(上海沪西分析仪器厂)；DHL-A电脑恒流泵(上海沪西分析仪器厂)；DBS-100电脑全自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂)。1.3 方法将黄瓜用清水洗净，称取100 g，以1.51 比例3加入pH7.8，0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液150 ml，先加75 ml磷酸盐缓冲液和少许石英砂，用高速组织捣碎机充分搅碎，在12 000 r/min，4离心40 min，使悬浮物完全沉淀，取沉淀再加入75 ml磷酸盐缓冲液，冰浴充分研磨，并12 000 r/min，4下离心40 min，弃去沉淀，合并两次上清液，制得粗酶液。将粗酶液静置于55恒温水浴锅中

10、25 min，进行热变性，使杂蛋白变性沉淀下来，再在4下12 000 r/min离心20 min，弃去沉淀，保留上清液。用0.1 mol/L盐酸调节上清液，使其pH达到5.0，在4下12 000 r/min离心20 min，收集上清液。在上清液中加入固体硫酸铵粉末，使溶液达到45%的饱和度后，用玻璃棒搅拌30 min，然后冷藏静置2h，再在4，12 000 r/min离心40 min，去除沉淀，取上清液；再加入固体硫酸铵粉末到90%饱和度，搅拌30 min，冷藏过夜，再在4，12 000 r/min离心60 min，取沉淀，溶解于pH7.8，0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液中，4透析过夜，待

11、上柱。    预先处理DEAE-纤维素，装柱，将待上柱的酶液加入层析柱中，用pH7.8，0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度控制在3 ml/min，以每管3 ml收集洗脱物，收集70管，将收集SOD活性峰的部分合并，测定蛋白峰处各管的酶活力(U)及蛋白质含量(mg)。将收集的酶液，4透析，再置于70冰箱中，冷冻过夜，用冷冻干燥机将酶液制成干粉，即为成品。1.4  SOD的鉴定本实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及SOD酶活性染色来鉴定纯化物确为SOD4。1.5  超氧化物歧化酶(SOD)活力测定用NBT光还原法来测定超氧化物

12、歧化酶的活性，根据光照时体系中产生氧自由基使NBT还原成蓝色甲簪(在560 nm处有一吸收峰)，而超氧化物歧化酶作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。酶活性单位采用抑制NBT光还原50%为一个酶活性单位表示5。1.6  蛋白质含量测定以考马斯亮蓝G250在595 nm波长下制作标准曲线，再进行样品液中蛋白质含量测定，根据所测定的A595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，重复3次取平均值，通过计算求出样品中蛋白质含量(mg)。2 结果2.1  沉淀法分离SOD本实验通过热变性沉淀法、等电点沉淀法从黄瓜中分离SOD，在此过程中，热变性温度、pH的选择均对分离提取SOD存在影响。    表1结果表明