固定化在合成化学工业及食品工业上之应用

1、固定化在合成化學工業及食品工業上之應用固定化酵素之微生物應用概況固定化合物應用年次胺基酸酵素DL-胺基酸之光學分割1969天冬酸(E. coli菌體)L-天冬酸之製造1973青黴素酸酵素6-胺基青黴素之製造1973葡萄糖異性化酵素高果糖漿之製造197374延胡索酸酵素(Brevibacterium ammoniagenes菌體)L-蘋果酸之製造1974天冬酸酵素L-天冬酸之製造1975乳糖酵素低乳糖奶之製造1977固定化酵素及固定化菌體之應用現況應用範圍應用及研究現況發酵工業胺基酸、糖、核酸、有機酸、生物鹼等之生產食品工業乳糖之分解、乾乳酪、高果糖漿、轉化糖等之製造、牛奶或食品之殺菌、酒精飲料

2、之製造、果汁苦味之去除、包裝食品之除氧等。化學工業酒精燃料、氫氣及甲烷氣體之製造、有機化合物之轉換等。分析氧電極法、微生物電極化、氧免疫測定法等之臨床檢查或種種化學分析之應用、測定之自動化、迅速化、簡便化等。醫療臨床檢查、氧治療劑、人工臟器等。環境淨化酚、苯、氰化物、Caprolactam oligomer之分解、硝酸或亞硝酸之還原、BOD或氰化物之測定等。生化學氧反應機構、氧之機能或構造之解析、採用親和力色層分析的生質成份之分離、濃縮、精製等。微生物的酵素製劑酵素生產菌種用途液化amylaseBacillus subtilisB. amyloliquefaciensB. stearother

3、mophilusAspergillus orizae纖維除糊劑、酒醪液化、製造水飴或葡萄糖、食品加工、消化劑。糖化amylaseRhizopus delemar葡萄糖的製造CellulaseTrichoderma virideIrpex lacteusMost of Wood-decayed fungi穀物、蔬菜、果實加工、消化劑、飼料添加劑。InvertaseSaccharomyces cerevisiae製造轉化糖、防止食品中的糖結晶。LactaseSaccharomyces fragilis防止冰淇淋中乳糖的結晶Glucose oxidaseAspergillus nigerPenici

4、llium motatum除去食品中的氧氣、防止食品變質。Glucose isomeraseStreptomyces albus果糖製造ProteaseAspergillus oryzaeAspergillus saitoiBacillus subtilisStreptomyces griseus消化劑、消炎劑、皮革工業、製麵包、除去啤酒或清酒之混濁、速釀味噌或醬油、食肉軟化劑、調味液的製造。PectinaseAspergillus nigerPenicillium sclerotiniaConithyrium diploidiella消化劑、milk flavor，羊皮洗淨、脂肪酸製造。Li

5、paseCandida cylindraceaCandida paralipolyticaRhizopus oryzae柑桔類之若味除去AsparaginaseEscherichia coli治療白血病、淋巴癌PenicillinaseBacillus cereusBacillus subtilisCheese的製造(除去牛乳中的penicillin)*一、 胺基酸1. DL-胺基酸之光學分割胺基酸之光學分割法有：物理化學法、化學法、生物學法、酵素法。其中酵素法係利用酵素特有的高光學特異性來進行光學分割之方法。在胺基酸結構中，只有L-胺基酸可被人體吸收，而D-胺基酸則無法為人體所吸收，然而自然

6、界中大多數的胺基酸是以DL-形態存在。故利用胺基酸分解酵素 (ammino-acylase)在DL-胺基酸之N-醯基(acyl-bond)衍生物中，僅加水分解L-型的性質，經結晶後可以純化L-胺基酸，留下的D-胺基酸與N-醯基消旋化後，形成DL-胺基酸，可再被ammino-acylase作用形成L-胺基酸。如此進行連續化反應便可大量製造L-胺基酸。將Aspergillus oryzae所生產的胺基酸水解酵素以吸附法、離子結合法、共價鍵結法、包覆法等固定化之後，使離子結合於DEAE-sephadex擔體中即可進行連續性固定化反應，用來生產L-胺基酸。離子結合的ammino-acylase很穩定及

7、安定，經過一個月仍有68%以上的活性，即便失活亦可用NaOH處理擔體除去酵素，再重新添加新的酵素就可再度使用。DEAE-sephadex可使用兩年。Ammino-acylase因具有基質特異性非常廣泛，固定化之後幾乎不會改變，固定化技術非常簡單，擔體可以重複使用，活性高，安定性良好等優點，故在工業上至今仍被採用。擔體的使用上，以海藻多醣的龍角菜與DEAE-sephadex混合後，滴入0.1M KCl，則可獲得半衰期120天的固定化胺基酸水解酵素。本法不僅使用在胺基酸水解酵素的固定，亦可應用於種種酵素及微生物菌體而獲得良好結果。2. L-胺基酸之合成化學合成或發酵所得之廉價化合物，若再經固定化酵

8、素或菌體來合成附加價值高的產物，是極為有意義的生物化學工業與化學工業流程。以天冬酸(asparate)為例，探討L-胺基酸之固定化生產：aspartaseHOOCCH=CHCOOH + NH3 HOOCCH2C(NH3)HCOOH如下圖：L-天冬酸鹽常用做治療心臟及其他各種疾病之醫藥品外，也用做果汁之食品添加物，具甘味之縮胺酸原料或醫藥製造原料等。目前用polyacrylamide固定化菌體(E. coli)，在37下半衰期為120日，mass transfer(質轉)的效果極佳。此乃世界上最早利用固定化微生物做連續酵素反應工業化生產的實例。以L-丙胺酸(alanine)為例：L-alanin

9、e可供醫療藥品外，在食品工業上用做鮮味劑亦被廣泛採用。原料：Pseudomonus dacunhae之L-aspartic acid-4-decarboxylase批式生產。千田認為分別將含aspartase之E. coli及L-aspartic acid-4-decarboxylase之Pseudomonus dacunhae 個別菌體固定化之後再混合使用，由丁烯二酸與氨直接製造L-alanine，則必可提高產量。如下圖：固定化菌體之調製方法與生物反應器有三種選擇：1. 將固定化之E. coli與Pseudomonus dacunhae分別充填於兩個反應器中(如No.1)2. 將分別固定化的

10、二菌體充分混合在一個充填反應器內反應。3. 先將二種菌先行混合後，再施以固定化在一個充填反應器內。其中以方法三的阻礙最大，而方法一在調整適當的pH值後效率最佳。下圖係利用上述方法加以工業化大規模生產L-aspartic acid及L-analine之流程圖。二、糖類利用固定化酵素進行多醣、少醣及雙糖類等之加水分解，或者單糖之異構化及氧化等之食品工業應用例子很多，例如乳糖之加水分解，葡萄糖異構化為果糖等。另外，由多醣類生產葡萄糖等之目的的工業化應用亦有諸多例子，如下表即為一些應用實例：表一、採用固定化酵素或固定化菌體之糖類轉換實例酵素、微生物固定化方法(擔體or載體)基質生產物-amylase共

11、價鍵結合法、吸附法、包覆法、超薄濾膜法澱粉糊精-amylase共價鍵結合法、吸附法可溶性澱粉麥芽糖Glucosidase共價鍵結合法、離子結合法、吸附法、超薄濾膜法糊精、麥芽糖葡萄糖Cellulase吸附法、包覆法、超薄濾膜法纖維素葡萄糖Glucose transferase或含此酵素菌體共價鍵結合法、吸附法、離子結合法、包覆法、中空纖維素法蔗糖轉化糖(葡萄糖+果糖)-1,4-glucanase共價鍵結合法-葡聚糖Glucose-1-phosphate-glucosidase共價鍵結合法麥芽糖葡萄糖-glucosidase包覆法半纖維素葡萄糖-galactosidase共價鍵結合法、包覆法、微

12、膠囊法牛奶乳漿低乳糖奶甜味劑-galactosidase中空纖維素法半纖維糖葡萄糖&分解乳糖Glucose isomerase或含此酵素菌體共價鍵結合法、吸附法、離子結合法、包覆法、微膠囊法葡萄糖果糖Gluconobacter melanogenes包覆法(polyacrylamide)L-清涼茶糖L-清涼茶酸Gluconobacter melanogenes + Pseudomonus syringe包覆法(polyacrylamide)L-清涼茶糖2-keto-L-葡萄糖酸Acetobacter suboxydans包覆法(polyacrylamide)糖醇酮糖1. 多醣類及少醣類

13、之分解將多醣類加水酵素分解，而利用所生成之葡萄糖等單糖類做為食用或發酵原料，是資源有效利用重要的課題。主要是由澱粉生產，以替代蔗糖的甜味劑，如高果糖漿(HFCS, High Fructose Corn Syrup)或纖維素(或木質素)製造葡萄糖等。由澱粉生產高果糖漿包括下列重要參與者：a. 由糖化菌(細菌或黴菌)糖化酵素液化澱粉成糊精。b. 由黑黴菌(Aspergillus niger)等之amylo-glucosidase將之糖化成葡萄糖。c. 由glucose isomerase將葡萄糖轉化為果糖之異構化。上圖為利用微生物酵素由葡萄糖造製異構化果糖的生產流程圖其特點是改用木質(xylan)

14、為原料，以培養高溫放線菌Streptomyces albus來生產異構化酵素(isomerase)，具有菌體直接催化之特性，此法可將50%高濃度之葡萄糖液裝入異構化反應槽內，經攪拌(pH6.87.2, 6570)反應約70小時，即可完成含40%葡萄糖及35%果糖，固形物75%之糖液。不但甜份高，且由玉米澱粉製造時，成本較砂糖為低。由於此法成功製造出甜度高之糖液，創新了異構化糖工業，逐漸替代傳統之製糖工業。這也是為什麼台糖甘蔗製糖逐漸式微之原因。近年來，如澱粉等高分子基質之分解，利用固定化酵素有效地加以分解，亦有工業化的趨勢，為此目的，利用超微細過濾膜反應器，亦即裝填酵素(如-amylase)於

15、反應器中，連續送入澱粉溶液，可連續取出葡萄糖。此時因為如酵素(蛋白質)或澱粉等高分子化合物無法透過超微細過濾膜，只有小分子如葡萄糖等可以過膜，所以不但製品的純度提高，且亦不會引起雜菌的污染。如此，所製得的葡萄糖可以直接用於製造葡萄糖液或再經異構化酵素製成果糖液，或作為發酵原料。採同樣的方法可以製成其他產品，如maltose, malto-triose等等。超微細過濾膜的操作比較簡單，故具有分解各種高分子物質的優點，此時選用膜孔直徑大小、溫度、基質的滯留時間等條件，可改變生成物的種類。2. 雙糖之分解雙糖分解中，以將蔗糖分解為葡萄糖與果糖的轉化酵素(invertase)，以及將乳糖分解成葡萄糖及

16、半乳糖的乳糖分解酵素(lactase)研究最多。 固定化轉化酵素或含轉化酵素的菌體的固定方法很多，固定化酵素的方法有：共價鍵 結合法、吸附法、離子結合法、包覆法、微膠囊法、中空纖維法、超微細薄膜過濾法等；而固定化菌體則常用吸附法、離子結合法、包覆法等。(Sucrose = glucose + fructose)(Lactose=glucose + galactose)乳糖分解酵素應用於工業上有兩個目的：一為提供不能消化乳糖(lactose)的人飲用牛奶(低乳糖奶)；二為製造乾酪(cheese)時，生成的乳清(whey)中萃取蛋白後，將殘留廢液(含乳糖)轉換為食品製造使用可能的甜味劑。3. 單糖

17、類之異構化單糖類的轉化最有名的例子為將葡萄糖轉化為果糖，其他則因特殊目的產物而使用不同固定化酵素種類而定，例如利用固定化菌體(Gluconobacter melanogenes與Pseudomonus sp.)L-清涼茶糖(L-sorbose)轉化為2-酮基葡萄糖酸(2-keto-glucuronic acid)(見表)。三、有機酸一些有機酸利用固定化酵素或固定化菌體生產，但其中由丁烯二酸(succinic acid)生合成L-蘋果酸已工業化。HOOC-CH2=CH2-COOH + H2O HOOC-CH2-C(OH)HCOOH(Brevibacterium ammoniagenes 生產fu

18、marase來反應)酵素菌體固定化法基質生成物Fumarase包覆法(cellulose-ethylacyl-cellulose)丁烯二酸L-蘋果酸Brevibacterium ammoniagenes包覆法(龍角菜、polyacrylamide)丁烯二酸 L-蘋果酸L-amino-oxidase共價鍵結合法、吸附法L-amino acid-keto acidLactobacillus delbreuckii超微細過濾膜法葡萄糖乳酸四、抗生物質(抗生素)抗生物質(antibiotics)一文係由發現鏈黴素(streptomycin)的學者Walksman S. A. (1924)所提出的，其定

19、義是由生物，尤其是微生物所生產的物質，阻止其他微生物以及其他活細胞(癌細胞等)機能之物質。同時培養二種類的微生物時，任一方的生長受到阻止時叫拮抗現象(antigonism)。1877Pasteur發現一種好氣性菌能抑制炭疽菌(B. anthracis)的生長。1929Fleming(英)首先發現penicillin，他發現培養在洋菜平板上葡萄球菌被青黴菌(Penicillium notatum)污染而受到抑制1940英國化學家Florey & Chain成功地使penicillin結晶化。1941美英共同開始研究大量生產的方法，次年採用表面培養法製造。1943開始使用tank培養法量產

20、，此乃抗生物質工業化的開始。1944Walksman發現streptomycin對結核菌有抑制效果。至今約有2000種以上的抗生素被發現，但實際應用的約100餘種而已。抗生物質的用途在醫藥(anticancer, antivirus, antibacterium)、農藥(fungiside, antibacterium, 如blastocidin S & Kasugamycin對稻熱病有效)、飼料中作為動物生長促進劑、生化方面如細菌細胞壁合成阻害物質(如penicillin)、蛋白質合成阻害物質(如chloramphenicol)、核酸阻害劑(actinomycin D, mitomy

21、cin C)等。抗生物質研究法菌種分離抗菌性試驗藥理試驗中間工業試驗1. 菌種之isolation & screening分離源一般為土壤，因其每克土壤至少含有109個細菌、108個放線菌及107個黴菌，但其他基質亦有相當龐大的生物多樣性供分離。將分離出來的菌種以液體振盪培養，再以paper disc方法做double layers抗菌性test，所獲得之抑制圈大小即可知道其抗菌力強弱。2. 生成抗生物質的分離篩選到具較強抗生活性之生產菌株時，其發酵液再以各種溶媒(通常八種以上)，跑PC (paper chromatography)或TLC (thin layer chromatography)使物質充分展開後，烘乾，貼在含有供試菌的洋菜培養上，使分離的物質擴散到培養基上，放置1020分鐘，再除去濾紙或TLC板，於供試菌適合生長的溫度下培養1224小時，若有抗生物質存在時，則呈透明區，測定其Rf值，必要時做純化結晶。3. 藥理試驗萃取純化抗生物質，進行口服、靜脈注射、皮下注射等動物的毒理試驗。培養液(或萃取後的廢料需要流放時，則再做魚類的毒性試驗。最後都無毒性時 ，則進入人體臨床試驗。4. 抗生物質的鑑定做藥理試驗的同時，可一方面從事物質純化與分子式結構式的分析。HPLC: 分離物質(fractions)。IR: 判別官能基。GC-