大鼠局灶性脑缺血再灌流损伤时神经细胞凋亡及其调控基因的表达_第1页
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文档简介

1、    大鼠局灶性脑缺血再灌流损伤时神经细胞凋亡及其调控基因的表达储照虎吴家幂刘富东袁存国 【摘要】目的探讨脑缺血再灌流损伤时神经细胞凋亡及其调控基因bcl-2的作用。方法采用大鼠大脑中动脉(MCA)阻断模型阻断血流2小时后再灌注,分别在不同再灌注时间将大鼠断头取脑,连续切片分别作HE、TUNEL染色及bcl-2蛋白免疫组化染色。结果(1)MCA阻断后脑缺血周边区部分神经细胞发生凋亡,随着再灌注时间的延长,一定时程内凋亡细胞逐渐增多,24小时达高峰,各组之间及与假手术组之间差异显著(P<0.01)。(2)凋亡抑制基因bcl-2在再灌注早期(6小时)

2、即达高峰,各组大鼠bcl-2表达亦存在显著差异(P<0.01)。(3)神经细胞凋亡的出现与bcl-2表达在一定时程内呈直线负相关(r=-0.747,P<0.01)。结论脑缺血再灌流损伤时,神经细胞凋亡起着重要作用,这种作用与bcl-2的表达等密切相关。 【关键词】脑缺血细胞凋亡抑制基因 Neuronal apoptosis during cerebral ischemic reperfusive injury and the expression of its regulating gene in rats Chu ZhaohuWu JiamiLiu Fudonget al (De

3、partment of Neurology,Yi Jishan Hospital.Wannan Medical College, Wuhu 241001) 【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of neuronal apoptosis and the role of its regulating gene bcl-2 in cerebral ischemic reperfusive injury. MethodThe middle cerebral artery (MCA) of rats was occluded for 2 h with

4、 MCAO model, and reperfusion. At each time rat brains were continuously cut to three sections for HE、TUNEL staining and bcl-2 protein immunohistochemical staining.Results1) The number of apoptotic cells increased with the development of reperfusion within a certain time, and reached its height in 24

5、 h. There was significant difference between each group and the sham operative group (P<0.01).2) The expression of apoptosis inhibiting gene bcl-2 reached its height at the beginning of reperfusion (6 h), and there was also a significant difference within rats bcl-2 in each group(P<0.01). 3) T

6、here was a negative correlation between the neuronal apoptosis and the expression of bcl-2 protein within a certain time(r=-0.747,P<0.01).ConclusionThe neuronal apoptosis might play an important role in cerebral ischemic reperfusive injury.it correlated with the expression of bcl-2. 【Key words】Ce

7、rebral ischemiaApoptosisInhibiting gene 脑缺血后,其中心区域的神经细胞很快出现坏死,但其周围的神经细胞却发生延迟性神经细胞退化(DND),已证明这种DND就是细胞凋亡,它出现的高峰在缺血后15天之间,并可持续4周左右1。由于实验方法、动物、缺血时间等差异,与此有关的文献报道不尽相同。细胞凋亡的发生常受一些相关基因的调控, bcl-2是研究较早、较多的一种抑制基因。我们采取大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)模型,观察其大脑中动脉(MCA)缺血再灌流后神经细胞凋亡的发生,对bcl-2基因的表达以及两者之间的相互关系进行探讨。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1

8、.1试剂原位凋亡检测试剂盒(北京医科大学病理系提供 pk 110,apoA液,apopB液即TDT酶,马血清,Anti-Dig-AP 1500,NBT 1100,BCIP 1100);bcl-2蛋白免疫组化试剂盒(福州迈新生物制剂有限公司提供);tris-HCL缓冲液(100 mM tris-HCL液,150 mM Nacl,50 mM Mgcl2,PBS缓冲液)。 1.1.2实验动物健康雄性SD大鼠40只,体重250300克之间,随机分为5组,每组8只,分别为MCA阻断再灌注30分钟组、6小时组、24小时组、72小时组及假手术对照组。 1.2实验方法 1.2.1大鼠MCAO模型制作参照Koi

9、zumi2腔内线栓法制作大鼠MCAO模型,并予以改进,于颈总动脉分叉切口处插入直径0.2 mm尼龙线约18.5±0.5 mm至大脑前动脉近端,以完全阻断MCA的血供来源,2小时后抽回尼龙线实现再灌注,然后在不同再灌注时间点(30分钟、6小时、24小时、72小时)将大鼠断头取脑。假手术对照组手术步骤同上,只是插入尼龙线深度为15 mm,此深度不可能阻塞MCA3。术中用100 w白炽灯照明,以保持大鼠肛温于37左右。 1.2.2实验阳性大鼠选择参照Bederson4的方法,有21只大鼠符合阳性标准:再灌注30分钟组5只,6小时组5只,24小时组6只,72小时组5只;另5只作假手术对照。对

10、无神经损伤症状者、术后2小时不能自发行走且意识丧失者及死亡者共14只均剔除在外。 1.2.3标本及切片制作大鼠断头取脑,在前联合处取冠状切片,石蜡包埋,最后连续取3张切片,中间片作HE染色,前后片分别作特殊染色(TUNEL及bcl-2染色)。 1.2.4凋亡细胞的检出及统计学处理显微镜下用计数器对整层切片进行凋亡细胞计数。各组切片TUNEL、bcl-2凋亡细胞个数分别用方差分析进行统计处理,两者之间的关系用直线相关进行分析。由于各切片凋亡细胞个数总体方差不齐,故采用x=lg(x+2)的变量变换,数据以均数()表示;直线相关分析用原始数据的均数表示。 2结果 2.1凋亡细胞出现部位TUNEL凋亡

11、细胞位于细胞核内,于再灌注30分钟时出现少量,位于纹状体水肿区周边;6小时时基底节区水肿加剧,其间出现小梗死灶,凋亡细胞位于其边缘;24小时时基底节区梗死灶扩大,边缘见大量凋亡细胞,皮层亦见凋亡细胞;72小时时凋亡细胞位于基底节及皮层的梗死灶外缘。bcl-2凋亡细胞位于胞浆,再灌注30分钟及6小时时弥散于基底节及皮层,24小时数量减少,限于大脑皮层边缘局部,72小时时近于无表达。 2.2定量分析 2.2.1方差分析大鼠脑缺血后各再灌注时间点切片TUNEL及bcl-2染色凋亡细胞检测结果见表1。5组大鼠TUNEL、bcl-2凋亡细胞数均有差别,经两两比较q检验表明:5组TUNEL凋亡细胞的10个

12、对比组两两比较均P<0.01,说明各对比组间细胞凋亡个数有显著差别,即在大鼠MCA阻断2小时再灌注30分钟时凋亡细胞已出现,24小时时达高峰,72小时时仍有较强表达,假手术对照组仅见极少量表达。5组bcl-2凋亡细胞10个对比组两两比较时发现:再灌注30分钟组、6小时组间以及72小时组、对照组间均P>0.05,其余各对比组间均P<0.01,说明MCA阻断2小时再灌注30分钟与6小时之间,72小时与假手术组之间的bcl-2凋亡细胞个数无差别,即MCA阻断2小时再灌注30分钟至6小时时,bcl-2凋亡细胞大量出现,其后凋亡细胞逐渐减少,72小时后已近乎于零表达。 表1各再灌注时间

13、点阳性细胞个数 组 别 TUNEL凋亡细胞 bcl-2阳性细胞 x x=lg(x+2) x x=lg(x+2) 再灌注30分钟组 (n=5) 8.2 0.994 186.4 2.273 再灌注6小时组 (n=5) 57.2 1.766 224.8 2.353 再灌注24小时组 (n=6) 227.5 2.359 28.5 1.468 再灌注72小时组 (n=5) 112.0 2.048 0.8 0.432 假手术对照组 (n=5) 1.6 0.536 0.2 0.336 数据经单因素方差分析F检验显示FTUNEL=289.301,P<0.01;Fbcl-2=493,P<0.01 2

14、.2.2直线相关分析大鼠脑缺血后各再灌注时间点切片TUNEL及bcl-2凋亡细胞的相关分析表明:TUNEL与bcl-2凋亡细胞随着再灌注时间的延长在一定时程内呈负相关关系(r=-0.747,P<0.01),即一定时间范围内,再灌注时间愈长,TUNEL凋亡细胞愈多,而bcl-2凋亡细胞愈少。 3讨论 人们认识到脑卒中后缺血区周边的神经细胞逐渐死亡与凋亡相关。Macmanus等5首先报道了大鼠脑缺血后“半暗区”出现大量的凋亡细胞。Benveyiste等6发现,脑缺血和再灌注早期细胞间液中兴奋性氨基酸如谷氨酸、天门冬氨酸等含量显著增高,同时还可以产生大量氧自由基,导致脂质过氧化反应,神经营养因

15、子缺乏可激活细胞内死亡基因表达,促使死亡蛋白合成,造成细胞凋亡。 我们的实验显示脑缺血再灌注后的细胞凋亡是一种动态进行性的过程,在缺血再灌注早期(30分钟时),前联合层纹状体缺血区出现明显水肿,水肿区的周围已出现少量凋亡细胞;随着再灌注时间延长(672小时),凋亡细胞个数增加(P<0.01),主要位于“半暗区”。在缺血早期,细胞间液中兴奋毒机理已被激活,氧自由基业已产生,尤其是“半暗区”,这里尚有少量侧支血供,再灌注后便会产生大量的氧自由基,促使细胞凋亡的发生。另外本实验还揭示脑缺血再灌注后,梗死以迟发性形式发展即再灌注24小时时梗死灶扩大,在这种梗死灶的边缘区域,以细胞凋亡为主,说明凋

16、亡在脑缺血引起的梗死灶发展中起重要作用。如不能及时纠正或预防,“半暗区”将不可避免成为永久性梗死灶的一部分,对梗死灶体积的扩大起一定作用。Li等7的实验也发现类似结果。 细胞凋亡时伴随着一些凋亡基因(如bcl-2)的表达,这些基因通过对凋亡细胞发生过程的干预而对凋亡进行调控。在我们的实验中,脑缺血再灌注30分钟时bcl-2基因即有高强度的表达,至6小时时仍维持在高水平,随着再灌注时间延长,bcl-2的表达渐减弱,至72小时时已同对照组无差别,此现象尚未见有文献报道。我们推测在脑缺血再灌注早期、细胞凋亡被诱导的同时,bcl-2基因亦被激活并且大量表达以试图遏止凋亡,据此认为bcl-2表达与细胞存

17、活密切相关,可能是神经细胞自我保护机理之一。再灌注早期凋亡细胞数目较少,也可能与bcl-2大量表达有关。 我们的实验结果还表明:在一定时间范围内,随着脑缺血再灌注时间的延长,细胞凋亡的发生与bcl-2的表达呈负相关(r=-0.747,P<0.01),这种相关关系尚未见有文献报道,我们分析之所以出现这样的结果,是由于抑制和促进凋亡的两种因素对比关系发生变化的结果,在缺血再灌注早期,包括bcl-2在内的抑制凋亡基因通过尚不十分清楚的机理大量表达,以试图实现细胞的自我保护;随着再灌注时间的延长,自由基生成增多,其它诱导凋亡因素持续存在,加之一些促凋亡基因亦大量表达,使得凋亡抑制、促进因素之间的

18、对比发生逆转,从我们的实验可以看出,bcl-2渐渐退居次要地位,最终它的表达被抑制。 通过对本实验结果分析我们认识到,脑缺血早期是治疗疾病的最佳时期,此时可以通过各种手段抑制凋亡的发生,以尽可能减少梗死体积的扩大。 本科题为安徽省教委科研基金资助(97JL-162) 作者单位:储照虎(皖南医学院弋矶山医院神经科241001) 吴家幂(皖南医学院弋矶山医院神经科241001) 刘富东(皖南医学院弋矶山医院神经科241001) 袁存国(皖南医学院弋矶山医院神经科241001) 参 考 文 献 1,Barinaga M. Stroke-damaged neurons may commit cellu

19、ar suicide .Science,1998,281:1303 2,Koizumi T, Yoshida Y, Nakazama T, et al. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.Jpn J Stroke, 1986, 8:1 3,Li Yi, Victor G, Sharov, et al. Ultrastructural and light Microscopi

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