实训二细菌标本片的制备及染色法实训指导

1、国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库 动物微生物与免疫技术实训二 细菌标本片的制备及染色法实训指导 实训目标 能利用不同的材料进行细菌标本片的制备，会进行常规染色，并认识细菌的不同染色特性。 仪器及材料 酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)、细菌病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等。方法与步骤 一、细菌标本片的制备 1抹片 根据所用材料不同，抹片的方法亦有差异。 (1)固体培养物 取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取12环的无菌生理盐水，放于载玻片

2、的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm的涂面。接种环用后需灭菌。 (2)液体培养物 可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液12环，在玻片上作直径1cm的涂面。 (3)液体病料(血液、渗出液、腹水等) 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端醮取血液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上，以45°角均匀推成一薄层的涂面。 (4)组织病料 以无菌剪刀、镊子剪取被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做数个压印或涂抹成适当大小的一薄层。 无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于染色和观察。 2干燥 涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰高处微烤加热干

3、燥。 3固定 固定的方法因染色方法不同而异。 (1)火焰固定 是最常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（一般46次），以手背触及玻片微烫手为宜。 (2)化学固定 有的血片、组织触片用姬姆萨染色时，要用甲醇固定35min。固定的目的是使菌体蛋白质凝固，形态固定，易于着色，并且经固定的菌体牢固粘附在玻片上，水洗时不易冲掉。 二、常用的细菌染色方法 1美蓝染色法 在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色23min，水洗，晾干或吸水纸轻压吸干和镜检，结果菌体呈蓝色。 2革兰氏染色法 (1)在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，染13min，水洗。 (2)加革兰氏碘液

4、媒染，作用12min，水洗。 (3)加95酒精脱色约30s至1min，水洗。 (4)加稀释石炭酸复红或沙黄水溶液复染30s左右，水洗，吸干后镜检。 结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 3瑞氏染色法 细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，13min后，再滴加与染色液等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗，干后镜检，结果菌体呈兰色，组织细胞等物呈其他颜色。 附 常用染色液的配制 1碱性美蓝染色液 甲液 美蓝 0.3g，95酒精 30ml 乙液 0.01苛性钾溶液 100ml 将美蓝放入研钵中，徐徐加入酒精研磨均匀后即为甲液，

5、将甲、乙两液混和，越夜后用滤纸过滤即成。新配制的美蓝染色不好，陈旧的染色好。 2革兰氏染色液 (1)草酸铵结晶紫染色液 甲液 结晶紫 2g，95%酒精 20ml 乙液 草酸铵 0.8g, 蒸馏水 80ml 将结晶紫放入研钵中，加酒精研磨均匀为甲液，然后将完全溶解的乙液与甲液混和即成。(2)革兰氏碘液(又称卢戈氏碘液) 碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵中，加入少量蒸馏水使其溶解，再放入已磨碎的碘片徐徐加水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入，再装入瓶中。 (3)稀释石炭酸复红溶液 取碱性复红酒精饱和溶液(碱性复红10g溶于95酒精100ml中)1ml和5石炭酸水溶液9ml混和，即为石炭酸复红原液。再取复红原液10ml和90ml蒸馏水混和，即成稀释石炭酸复红溶液。瑞氏染色