应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光免疫试剂-医药卫

1、应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光免疫试剂-医药卫    摘要 目的摘要：合成(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，并用于构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨免疫荧光试剂。方法摘要：用PVA作为载体结合BCPDA?Eu3+和生物素?亲和素，以双抗体夹心法原理，结合生物素标记抗体和包被抗体建立PAPP?A时间分辨免疫荧光试剂，并进行方法学评价。结果摘要：成功的合成了活性的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，构建PAPP?A试剂检测灵敏度为0.7 mIU/L；批内变异系数在3.89%4

2、.96%之间,批间变异系数在7.35%9.27%之间。结论摘要：合成的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物较高的反应活性，可以用于多种试剂的构建。构建的PAPP?A试剂灵敏度高，具有潜伏的临床应用价值。 妊娠相关血浆蛋白A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素生物素聚乙烯胺4,7二氯磺苯基?1，10啡罗啉?2，9二羧酸铕复合物；唐氏综合征Develop A Direct Solid Phase Lanthane Time?resolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPP?Autilizing PVAAbstract 摘要:Objecti

3、ve To develop a direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassayreagent of PAPP?A by synthesizing a complex of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+. Methods Polyvinylamine (PVA) was labeled with biotin?streptavidin and europium chelate of 4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicar

4、boxylic?acid(BCPDA). Using labeled PVA complex,We designed two?site sandwich time?resolved fluoroimmunoassay of PAPP?A and evaluated assay characteristics of PAPP?A kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+ and a reagent of PAPP?A. Detection limits achieve

5、d were 0.7mIU/L.The calibration curve was linear 0?10000mIU/L.Intra? and interassay imprecision (CV) was 3.89%?4.96% and 7.35%?9.27%.Recovery was 95.8%?104.2%. Conclusions The conjugate of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+ synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of kit could be synthesiz

6、ed ,taking advantage of it. The reagent of PAPP?A was potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity.Key words摘要: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassay; Streptavidin?biotin?Polyvinylamine? europium chelate of 4,7?

7、bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic?acid; Down's Syndrome妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy associated plasma protein A，PAPP?A)是一种高分子2糖蛋白，20世纪70年代在孕妇血清中被发现1。在孕妇血中主要PAPP?A是胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为200 000250 000亚基构成。PAPP?A亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白(Proform of eosinophil major basic protein)以二硫键结合

8、而成2，在孕妇血中只存在微量游离单体PAPP?A。PAPP?A亚基由1 547个多聚核苷酸构成，包括1个拉长的锌指结构，3个Linnotch重复序列，以及5个短一致重复序列3。在体内PAPP?A是一种蛋白酶，主要针对胰岛素样生长因子结合蛋白4(IGFBP?4)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(IGFBP?5)起功能。胰岛素样生长因子I(IGF?I)在促进细胞*和增殖起重要功能，它主要通过IGF?1受体起功能，IGF?I、II的生物活性受6个高亲和性IDFBP调节4，5。PAPP?A主要用于产前筛查唐氏综合征(Down's Syndrome，DS)，迄今医学上对此病尚无有效的治疗和预防办法，

9、只能通过产前筛查防止DS儿的出生，但目前开展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵进性检查,有1%3%的流产率,且方法繁琐,出报告时间长,不适宜大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。大量报道以为PAPP?A可作为DS胎儿产前筛查的的标志物。在15周20周通过结合孕妇孕周、超声诊断和Free?HCG可以鉴别65%75%，但要在3个月6个月结合AFP、游离E3以及抑制素上述成分可鉴别85%90%6。有文献7报道PAPP?A在急性冠状动脉综合征(ACS)的早期诊断有一定的意义，PAPP?A在ACS患者血清含量30 mIU/L，同时结构不同于孕妇体内的PAPP?A且存在动态变化，必须利用超灵敏的方法

10、进行检测。国内PAPP?A的诊断试剂大多为ELISA和PerkinElmer公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫分析(dissociated enhance lanthane time?resolved fluoroimmunoassay,DELFIA)试剂，无国产PAPP?A时间分辨荧光试剂。我们利用PVA(聚乙烯胺)作为载体结合BCPDA镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫分析(direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DSLFIA)试剂。为进步检测灵敏度和克服BCPDA标记抗体使抗体失活的新题目，我们引

11、进了生物素?亲和素(biotin?streptavidin system)系统。1材料和方法1.1材料1.2方法2结果2.1用HPLC纯化(Bio)x?PVA?(BCPDA)y复合物在10 min16 min 出现(Bio)x?PVA?(BCPDA)y的吸收峰，没有结合BCPDA的吸收峰在17 min24 min出现,见图1。图1净化（Bio）x聚乙烯醇（BCPDA）y在高性能液化色谱（TSK250过滤柱）上的变化图。（略）流速控制在0.8 ml/min，吸光率325 nm2.2用滴定法确订婚和素和(Bio)x?PVA?(BCPDA)y最佳配比SA量恒定0.01 mg/ml，生物素标记的抗体包

12、被分别浓度为0 ng/孔、0.5 ng/孔、5 ng/孔、50 ng/孔，缓冲液为pH 7.8 Tris?Hcl 0.1M，Eu3+ 10-5 M，(Bio)x?PVA?(BCPDA)y用量从40 l55 l选择最佳值，50 l复合物荧光强度值(cpm)最佳，如图2。图2滴定链球菌，（Bio) x聚乙烯醇（BCPDA）y在10-3 M Eu3+,0.1 M Tris-Hcl buffer(pH 7.8)缓冲液中的变化，0.01 mg/ml 链球菌，容积变动范围40 l55 l，观察到最佳容积为50 l（略）2.3验证活性用生物素化的各种浓度(0 ng/50l，0.5 ng/50l，5 ng/5

13、0l，50 ng/50l，100 ng/50l)鼠IgG包被96孔微板验证(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物的反应活性，在测定范围内成线性分布，见图3。图3IgG维生素定量法标定曲线（略）2.4PAPP?A定标曲线及灵敏度在0 mIU/L10 000 mIU/L范围内定标曲线为线性分布，见图4。S0标准重复20次检测均值加2个标准差值代进标准曲线，计算出检测限为0.7 mIU/L(数据没显示)。 图4PAPP-A标定曲线（略）2.5批内、批间精密度对质控血清批内进行20次分析，批间进行12次分析，得到批内变异系数3.89%4.96%,批间变异系数在7.35%9.

14、27%之间,见表1。表1批内、批间变异系数比较（略）2.6回收实验对收集样本(P1 、P2 、P3 )依据定标分析过程进行丈量，然后将Control1、Control2、Control3分别等体积加进P1 、P2、P3中进行多次丈量，分别计算回收率95.8%104.2%,见表2。表2回收实验结果比较（略）3讨论临床化学家最关心的新题目是分析技术灵敏度，这也是临床诊断试剂的核心。近来，在临床化学检测物质的浓度的范围10-3 mol/L10-16 mol/L。PCR以及其他的体外扩增技术使DNA、RNA检测方便、高效、特异。不幸的是蛋白不能复制，最敏感的定量方法是依靠蛋白之间的特异性结合如抗原抗体

15、反应。一个进步蛋白检测灵敏度的方法就是信号放大，即在蛋白上标记可以检测的标记物，通过标记物的信号放大而达到更轻易检测的目的。时间分辨免疫学技术是80年代迅速发展起来的的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术，其中荧光镧系螯合物具有较大的Stokes 位移(275 nm)，较窄的发射光谱(10 nm)，较长的荧光寿命(10 us1 000 us)，而被广泛构建时间分辨荧光免疫试剂。临床运用最广泛的是PE公司生产的解离增强镧系时间分辨荧光免疫分析(dissociation?enhanced lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA)试剂 ，它必须使Eu3+和螯合物

16、分离，由于其信号较弱，必须加进增强液来发大信号，操纵烦琐且在加样的过程中可能引起外源性的污染，这些弊端影响了它的应用。在1987年，Evangelista和Diamandis合成一种新的螯合物BCPDA，开创了固相时间分辨免疫荧光技术，解决了DELFIA上述新题目8，9，但是BCPDA的较大分子量、表面特性和直接标记蛋白轻易引起蛋白的失活对它应用带来一些新题目，解决的办法就是连接一个载体。我们实验中引进了PVA作为载体，连接BCPDA和生物素?亲和素。PVA直接连接蛋白技术难度较大，而生物素标记蛋白技术比较成熟，同时亲和素有4个生物素结合位点，可以起到信号放大功能，而进步检测灵敏度。我们实验中

17、成功的合成了(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物，用它往识别生物素标记的抗体(见图3)，结果显示亲和力非常高。实验关键新题目是选择SA和(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物最佳比，我们实验中做了7个浓度梯度，选取结合后荧光强度最大的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物浓度。利用HPLC层析纯后的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物回收率是68%。通过实验选择最佳检测抗体浓度、生物素化抗体浓度和标本用量。Jackson13分析了进步灵敏度的因素即两个关键的因素和终极的结合分析灵敏度相关摘要：我们监测标记分子(放射

18、性同位素、化学发光剂、荧光团)的能力；结合试剂的质量和实验条件，在临床化学存在一种误导是非凡敏感的监测方法(化学发光、时间分辨荧光)能获得好的结果。实在这是错误的，假如实验试剂和条件(抗体的亲和性和特异性，固相结合物的自然特性以及清洗效率)不被选择，很难达到理想的检测效果。为达到较高的灵敏度，需要选择高灵敏度的标记技术、高亲和力的试剂和最好的分析条件(可将试剂的非特异性结合降到最小)。利用镧系螯合物的时间分辨荧光免疫分析是一种高灵敏的标记技术，关键是实验条件的选择，我们验证不同孵育时间下，(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+复合物产出率，以及和生物素化抗体的结合能力(数据不能显示)。经过大量的实验选