Autotaxin多克隆抗体的制备

1、Autotaxin多克隆抗体的制备         11-01-30 10:12:00     编辑：studa20                    作者：李颂, 姜望舒, 邱洋, 张俊杰【摘要】  目的: 表达和纯化带多聚组氨酸（6×His）标签的Au

2、totaxin（58157位氨基酸）融合蛋白, 制备抗Autotaxin的多克隆抗体。方法: 构建pET21cAutotaxin(58157)重组表达质粒, 转入BL21大肠杆菌, IPTG诱导蛋白表达, 经镍离子金属螯合树脂纯化后, 用纯化的蛋白免疫家兔, 制备抗Autotaxin的多克隆抗体。ELISA检测抗体效价, Western blot检测抗体特异性, 并用于免疫组化实验。结果: 在大肠杆菌中高表达Autotaxin(58157)His6融合蛋白, 经亲和纯化后免疫家兔, 获得了特异性的抗Autotaxin抗血清。结论: 成功构建pET21cAutotaxin(58157)表达质粒,

3、 原核表达获得高纯度的目的蛋白, 制备出高效价的特异性抗Autotaxin多克隆抗体。 【关键词】  Autotaxin; 原核表达; 多克隆抗体Autotaxin（ATX）是一个分泌型糖蛋白, 具有5核苷磷酸二酯酶（phosphodiesterase,  PDE）活性, 是胞外焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ectonucleotide pyrophosphate/phosphodiesterase,  ENPPs）家族的一员1。 ATX还具有溶血磷脂酶D（lysoPLD）活性, 能够以溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidycholine,  LPC）为

4、底物催化生成溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,  LPA）2。通过对ATX缺失杂合体小鼠和野生型小鼠的比较发现, ATX缺失杂合体小鼠血清中LPA的含量和ATX的活性均为野生型小鼠的一半。这一结果从整体上进一步表明ATX是体内催化产生LPA的重要物质3。LPA作为一种能够与Edg家族G蛋白偶联受体结合的脂类信号分子, 与肿瘤关系密切。它可以促进癌细胞增殖、 分化、 调节细胞间相互作用, 抑制细胞死亡, 提高细胞的运动性、 侵染性, 并促进细胞产生细胞因子4。    ATX在很多肿瘤细胞中都有高表达, 在肿瘤的发生、 发展过程中有着重

5、要作用, 被认为是肿瘤治疗中一个可能的靶位5。此外, ATX在神经系统6、 免疫系统7中也发挥重要作用。以往研究结果表明, ATX可以作为一些肿瘤的诊断、 预后标记。例如, 有研究发现ATX可以作为眼色素层黑素瘤患者预后状况的判断指标8;  ATX含量在术后前列腺癌患者体内下降, 它可能成为前列腺癌的预后指标9。最近有研究发现在慢性丙肝患者的血清中ATX表达量显著上调, 认为ATX可能在肝癌的发生过程中起关键作用10。基于ATX在肿瘤发生、 发展中的重要作用, 对其表达调控机制的研究和抑制剂的开发成为研究热点。制备高效价、 高特异性的抗Autotaxin多抗将有助于与Autotaxi

6、n相关的理论和应用研究。1  材料和方法1.1  材料  pET21c原核表达载体、 BL21大肠杆菌菌株由本实验室保存。人卵巢癌细胞株SKOV3由ATCC购买。SKOV3培养于含有100 U/mL青霉素（Invitrogen）、 100 U/mL链霉素（Invitrogen）, 2 mmol/L的L谷氨酰胺（Invitrogen）, 100 mL/L胎牛血清（Hyclone）的RPMI1640培养基（Gibco）中。培养于含50 mL/L CO2,  37的恒温培养箱中（Thermo）。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）购自Merck公司;  T

7、RIzol购自Invitrogen公司; 反转录试剂盒购自Promega公司; 限制性内切酶、 Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司; NiNTA Resins购自Novagen公司; BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。羊抗兔辣根过氧化物酶偶联抗体购自中杉金桥生物技术有限公司。1.2  方法21cAutotaxin(58157)原核表达质粒的构建  从高表达Autotaxin的人卵巢癌细胞系SKOV3中抽提细胞总RNA, 用Promega反转录试剂盒合成cDNA。PCR扩增Autotaxin蛋白58157位氨基酸对应的cDNA。PCR

8、引物由上海生工生物技术公司合成, 序列如下: 上游引物5GGAATTCATATGTCTTGCAAGGGCAGGTGC3, 下游引物5CCGCTCGAGGCATTCTGCGGCCTTTATTTC3。PCR扩增条件为: 94预变性5 min; 94变性30 s, 58退火30 s, 72延伸40 s（30个循环）; 72 10 min。 选用Nde I、 Xho I酶切位点, 将PCR产物克隆入pET21c质粒, 转化BL21大肠杆菌菌株。157)His6融合蛋白的诱导表达及纯化  将含有pET21cAutotaxin(58157)质粒的E.coli BL21菌株接种于LB培养液中, 培

9、养至A600大约为0.6左右, 加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L诱导4 h。 6 000 r/min离心收集菌体。用裂解缓冲液（300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L磷酸盐缓冲液, 10 mmol/L咪唑, pH8.0）重悬, 冰上超声破碎菌体, 12 000 r/min离心30 min, 收集上清。上清与NiNTA Resins混合, 经漂洗缓冲液（300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L磷酸盐缓冲液, 20 mmol/L咪唑, pH8.0）洗涤, 洗脱缓冲液（300 mmol/L NaCl, 250 mmol/L磷酸盐缓冲液, 50 mmol/L咪唑, p

10、H8.0）洗脱收集蛋白。纯化得到的蛋白经PBS 4透析过夜, BCA法定量。157)His6融合蛋白与弗氏完全佐剂等量乳化后, 对家兔进行免疫。免疫6次后采集抗血清。2  结果2.1  Autotaxin 58157位氨基酸对应的cDNA的PCR扩增和克隆  从高表达Autotaxin的SKOV3细胞系中抽提总RNA, 逆转录获得出的cDNA。以cDNA为模板, PCR扩增Autotaxin蛋白58157位氨基酸对应的cDNA序列（300 bp）。结果表明扩增片段大小与预期值相符（图1）。选用Nde I、 Xho I酶切位点, 将PCR产物克隆入pET21c质粒,

11、 并对重组质粒进行了双酶切鉴定（图1）和序列测定。图1  Autotaxin(58157)His6原核表达质粒的构建（略）1: DNA marker （DL 5 000）;  2: PCR产物; 3: pET21cAutotaxin(58157)质粒酶切鉴定. 2.2  Autotaxin(58157)His6融合蛋白的诱导表达及纯化  与未诱导的菌株相比, 转化了pET21cAutotaxin(58157)重组质粒的E.coli BL21菌株, 经过IPTG诱导在相对分子质量（Mr）11 000和17 000之间出现了1条明显的条带, 大小与

12、Autotaxin(58157)His6的理论值13 000相符（图2）, 表明重组蛋白诱导表达成功。超声破碎后, SDSPAGE分析表明目的蛋白存在于上清中, 即目的蛋白可溶。经过亲和纯化, 将获得的目的蛋白进行SDSPAGE分析, 可见单一的条带, 证明蛋白纯化成功, 纯度达到90以上（图2）。经过PBS透析后, 用BCA法测定蛋白浓度, 纯化蛋白浓度为2.7 g/L。图2  Autotaxin(58157)His6蛋白的表达与纯化（略）M: 蛋白marker; 1: 未诱导的菌体蛋白; 2: 诱导后的菌体蛋白; 3: 超声破碎后的上清蛋白; 4: 杂蛋白洗脱液中的蛋白; 5:

13、空白洗脱缓冲液; 6: 亲和纯化的蛋白.2.3  多克隆抗体的效价测定  将透析定量后的Autotaxin(58157)His6融合蛋白与弗氏完全佐剂等量乳化后, 对家兔进行免疫, 免疫6次后采集抗血清。将免疫6次后采集的抗血清作为阳性血清（P）, 以家兔免疫前血清作为阴性对照（N）, 用纯化的Autotaxin(58157)His6蛋白为抗原, 间接ELISA法测定多克隆抗体效价。以不加抗原的空白孔的吸光度校零后, 2倍于阴性对照吸光度值的抗体最高稀释倍数作为抗体的效价。如表1所示, 抗血清的效价达到125 000, 说明经过6次免疫, 家兔体内产生了高效价的抗体。2.4

14、  多克隆抗体特异性的测定  为了检测多克隆抗体是否可以特异性地检测到ATX蛋白, 用pcDNA4Autotaxin瞬时转染HeLa细胞, 分泌表达全长Autotaxin, 并以转染空载pcDNA4的HeLa细胞为阴性对照。制备的抗Autotaxin多克隆抗体在pcDNA4Autotaxin转染的HeLa细胞培养上清中可检测到大小为125 000的单一条带（图3）, 与Autotaxin的大小相符, 转染空载pcDNA4的阴性对照中则没用信号, 表明制备的多克隆抗体可以灵敏、 特异地检测细胞培养上清中的Autotaxin。表1  抗Autotaxin多克隆抗体的效价检测（略）2.5  多克隆抗体在免疫组化中的应用  选取结直肠癌组织标本进行免疫组化检测。与免疫前的阴性血清相比, 制备的抗Autotaxin多克隆抗体在结直