RP-HPLC荧光衍生化法测定人血清中胆固醇和胆甾烷醇含量

1、    RP-HPLC荧光衍生化法测定人血清中胆固醇和胆甾烷醇含量        摘要应用荧光试剂2-(4-羧基苯基)-4，5-萘骈咪唑(CNI)为衍生化试剂，用RP-HPLC法测定人血清中胆固醇和胆甾烷醇含量。色谱条件：zorbax Bp C8柱(250 mm×4.6 mm，ID)作色谱柱；乙腈-甲醇(9010)为流动相；二十二烷醇作内标。平均回收率分别是96.19%和94.81%，进样量20 L时最低检出质量浓度分别为1.0 g/L和1.5 g/L。关键词RP-

2、HPLC法;荧光衍生化;胆固醇;胆甾烷醇中号R927.2文献标识码:A文章编号:1006-8783(2000)01-0028-02 正常人血清中胆固醇和胆甾烷醇的浓度通常是一个定值。某些疾病会引起该值的变化，例如，甲状腺机能减退、糖尿病、胆道阻塞等病症的患者，该值会升高；相反，甲状腺机能亢进、严重贫血、急性感染等病症的患者该值会降低1。有报告指出血清中胆固醇和胆甾烷醇浓度的变化可作为先天性代谢异常疾病的脑腱黄瘤病(Cerebrotendinous Xanthomatosis,CTX)诊断的重要指标2。因此其含量测定，在临床诊断及药物研究中是有重要意义的。血清中胆固醇的测定方法有分光光度法、酶法

3、、气相色谱法、气质联用法和高效液相色谱法等3。而血清胆甾烷醇浓度低，测定较困难。近年来，随着新的荧光衍生化试剂的开发，其定量方法迅速得到开发和利用4、5。本实验用作者自行合成并具有高灵敏度、衍生化条件温和的2-(4-羧基苯基)-4，5-萘骈咪唑衍生化试剂，参考笔者测定醇类所建立的方法6，测定了血清中胆固醇(Cholesterel,CE)和胆甾烷醇(Cholestanol,CA)的含量，得到满意的结果。1仪器与试药日立650-10S荧光分光光度计；日本岛津LC-4A型高效液相色谱仪；岛津RF-530型荧光检测器；岛津C-R2AX型数据处理机。胆固醇、胆甾烷醇、二十二烷醇(均为东京化成化学工业公司

4、产品，优级纯)分别用二氯甲烷配成1 mg/mL。胆甾烷醇和二十二烷醇临用前用二氯甲烷稀释成1 g/mL，备用。4-Piperidino-pyridine(PIP,Aldrich公司产品，优级纯)，I-isopropyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide perchlorate(IDC,关东化学公司产品，优级纯)分别用CH2Cl2配成=0.4%的溶液备用。2-(4-羧基苯基)-4，5萘骈咪唑(CNI，本室合成，测定为纯品)用二氯甲烷配成=0.04%备用。其它试剂均为东京化成化学工业公司生产，优级纯；水为蒸馏后去离子水。2色谱条件色谱柱：zorbax B

5、p C8(250 mm×4.6 mm，ID)；流动相：乙腈-甲醇(9010)；流速：1.0mL/min；室温；荧光检测波长：ex345 nm,em485 nm；内标：二十二烷醇。3线性关系考察精密量取人血清0.01 mL 6份×2组，分置10 mL具塞离心管中，向其中一组各管分别加入0.01 mL内标溶液(1 mg/mL)，再分别加入胆固醇标准溶液0、5、10、15、20、25 L；另一组各管分别加入0.01 mL内标溶液(1 g/mL)，再分别加入稀释后的胆甾烷醇标准液0、5、10、15、20、25 L；两组各管分别加入环己烷2.00 mL，水1.00 mL，旋涡混合1

6、min。取有机层1.00 mL，置另一具塞试管中，用氮气流挥去溶媒，再分别加入二氯甲烷0.7 mL、CNI溶液、PIP溶液(催化剂)、IDC溶液(缩合剂)各0.10 mL，具塞、混匀，80 水浴加热10 min后，取出，用氮气流挥干溶剂，残留物用0.50 mL乙腈定容，取20 L进样，HPLC分析。结果，从各项测得值中减去背景值后，以组分与内标峰高比对浓度作线性回归，分别测得血清胆固醇标准曲线为Y=0.3870X+0.011,r=0.9992,线性范围02.5 mg/mL。在1.0 mg/mL处测得日内精密度RSD为0.4%(n=9),日间精密度RSD为2.0%(n=5)。血清胆甾烷醇标准曲线

7、为Y=0.3581X+0.019,r=0.9980,线性范围02.5 g/mL，在1.0 g/mL处测得日内精密度RSD为0.9%(n=9)，日间精密度为3.6%(n=5)。4回收率测定分别取血清0.01 mL 3×5份×2组，其中一组分别加入3个不同体积的胆固醇标准液5、10、20 L，每个体积5份；另一组分别加入不同体积的胆甾烷醇稀释后标准液5、10、20 L，每个体积5份，依“线性关系考察”项下方法操作，分别测得浓度在0.5、1.0、2.0 mg/mL处胆固醇的回收率分别为95.4%±2.2%、96.2%±1.3%、97.0%±1.3%；

8、浓度在0.5、1.0、2.0 g/mL处胆甾烷醇的回收率分别为93.5%±3.7%、95.2%±3.3%、95.7%±1.1%。进样20 L时，检测限分别为1.0 g/L和1.5 g/L。5样品测定5.1血清中总胆固醇和总胆甾烷醇的测定精密量取人血清0.01 mL置10 mL具塞离心管中，加入内标溶液0.01 mL(1 mg/mL)及=3%KOH溶液1.0 mL，加塞，混和1 min，置37 水浴，水解反应60 min后，冷至室温，依“线性关系考察”项下，从“精密加入环己烷2.0 mL”起同样操作，测得结果用标准曲线计算胆固醇含量；用相同方法，但内标液换为浓度1

9、g/mL，同法分析胆甾烷醇含量，结果见表1，色谱见1。5.2游离胆固醇和胆甾烷醇测定，同上方法，但不加KOH溶液水解，进行提取、衍生化反应和色谱测定。结果见表1。1血清中胆固醇和胆甾烷醇CNI衍生物的HPLC色谱A 胆固醇胆甾烷醇和二十二烷醇CHI衍生物色谱B 血清中胆固醇和胆甾烷醇色谱(0.1AUFS)C 血清中的胆甾烷醇色谱(0.005AUFS)1，2，5 杂质峰；3 二十二烷醇峰(i.s);4 胆固醇峰;6 胆甾烷醇峰表19例健康自愿者血清中胆固醇和胆甾烷醇含量编号年龄性别CE(f)mg/mLCE(t)mg/mLCA(f)g/mLCE(t)g/mLCE(f/t)%CA(f/t)%CA(t

10、)/CE(t)%146男0.652.470.782.1626.326.10.09242男0.542.090.631.9825.831.80.10335男0.421.600.441.4026.331.40.09435男0.391.560.471.4825.031.70.10524男0.551.560.541.9135.228.30.22643女0.842.350.531.8035.729.30.08723女0.441.530.531.5128.835.10.10849女0.671.990.541.9633.727.70.10948女0.592.110.411.7728.023.20.090.56

11、1.920.541.7729.430.50.11s0.130.340.100.244.023.710.04注：CE(f) 游离胆固醇CE(t) 总胆固醇CA(f) 游离胆甾烷醇CA(t) 总胆甾烷醇 6讨论6.1该衍生化反应为酯化反应，为使反应顺利进行，并降低反应条件，经考察，以二氯甲烷为溶剂，并加入=0.4%的PIP作催化剂、=0.4%的IDC作缩水剂，效果最好。6.2由于胆甾烷醇血清浓度约为胆固醇的千分之一左右，因此内标液也稀释1000倍，以减少测量误差。6.3本实验测得人血清胆固醇的量与有关资料所报导一致，但胆甾烷醇不同方法测得结果有较大误差，估计由于体内浓度低以及仪器和人为误差造成，同

12、时也存在个体差异，需进一步探讨1，5。周宏兵（广东药学院药物分析教研室，广东广州 510224）参考文献1姚磊，刘军，徐桂荣，等.医学实用数据手册.北京：中国广播电视出版社，1993.971.2T.Iwata, H.Yamaguchi,M.Nakamura.Highly sensitive and Simple Determination of Cholesterod and Cholestanol in Human Serum hy High-Performance Liquid Chromatography with Fluorescence Detection.J Chromatog,1

13、987,421:43.3由歧英刚.生化学分析法.东京：中山书店，1984.399.4M.Katayama,R.Masuda,H.Taniguchi.Detemination of alcohols by HPLC after Pre-Column cleri vatization with 2-(4-carboxy phenyl)-5,6-alimethylbenzimialazole. J Chromatog,1991,585:219.5M Nakajima,S.Yamata,H.Wakabayashi.High-Performance Liquid Chromatographicn Determination of cholesterol and cholestanol in Human Serum by precofumn Derivatization with 2-2-(Isocyanat)ethyl-3-methy