iNOSN端融合蛋白在大肠杆菌中的表达及抗体制备

1、    iNOS N端融合蛋白在大肠杆菌中 的表达及抗体制备        【 摘要 】目的表达iNOS N端片段并制备iNOS特异性抗体。 方法将iNOS N端片段装入原核表达载体pET-28a(+)，在大肠杆菌BL21中表达，His.BindTM柱亲和层析分离纯化及凝胶蛋白回收的两步纯化法纯化目的蛋白，使用纯化蛋白制备iNOS多克隆抗体。结果得到具有较高表达量的融合蛋白，经两步纯化获得iNOS N端融合蛋白纯品，将此蛋白免疫家兔，得到iNOS多克隆抗体

2、，Western blot证实该抗体具有较好的反应性及特异性。 结论原核表达iNOS N端片段制备iNOS抗体具有很好的特异性。【 主题词 】iNOS重组蛋白特异性抗体 Expression of iNOS N-terminal in E.coli and preparation of the specific antibody against iNOS PAN Ying ,ZHU Minsheng, SHEN Yue,et al Nanjing Military Medical Institute, Nanjing 210002【 Abstract 】ObjectiveTo express

3、iNOS N-terminal fusion protein and prepare specific antibody against iNOS. Methods A fragment of iNOS(1-196AA) was inserted in pET-28a(+) plasmid and the combinant construct was transformed into BL21 E.coli. The expressed protein was purified by two steps: 1. purification with a His.BindTM column; 2

4、. recovery from SDS-PAGE gel . The antibody was raised by immunizing rabbits with purified protein. ResultsA high level expression of the target protein was found after IPTG induction and fine purified target protein was obtained by two steps purification. A polycolonal antibody was raised in the ra

5、bbit against the purified recombinant protein, Western blot analysis revealed that it did not cross-react with nNOS and eNOS. Conclusions The antibody against iNOS which was prepared by iNOS N-terminal fusion protein has good specificity and reactivity.【 Subject words 】iNOSRecombinant proteinSpecifi

6、c antibody一氧化氮（NO)及一氧化氮合酶（NOS）为近年的研究热点之一，NOS是体内合成NO的限速因素，它有三种同工酶：iNOS(诱生型）、nNOS（神经型）、eNOS（内皮细胞型）。nNOS与eNOS统称cNOS（结构型），正常生理情况下就存在于神经细胞、内皮细胞、骨骼肌、血小板等处，而iNOS必须在诱导情况下方可产生，其在细胞因子或LPS等诱导条件下表达，合成的NO是机体防御的重要因子，在微生物及免疫学上具有重要意义，其过量表达与自身免疫性疾病、败血症休克等疾病有关1。在iNOS的研究中，特异性抗体是一重要的研究工具，国外已制备成功iNOS特异性抗体，而国内尚无这方面的报道。本实

7、验室将iNOS N端片段进行原核表达，采用两步纯化法得到高纯度的重组蛋白，以此蛋白免疫家兔获得了高效价的特异性抗体。材料与方法1.质粒与菌株：pCMV/iNOS质粒（含小鼠iNOS全长cDNA)，由美国西南医学中心提供，pET-28a(+)表达质粒购自 Novagen公司，BL21菌株由本实验室保存。2.酶和蛋白质及常用试剂：各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶购自Boehinger-Mamnhein, Promega及华美公司，/Hind分子量标准购自GIBCO-BRL公司，His.BindTM-sepharose购自Novagen公司，iNOS、nNOS、eNOS标准品及iNOS抗体由美国

8、西南医学中心提供，常用化学试剂为国产或进口分析纯试剂。3.PCR扩增、基因重组技术及Western blot分析：按文献2，3进行。4.重组蛋白的纯化：按Novagen公司His.BindTM-sepharose树脂使用说明书进行亲和层析纯化，得到的初步纯化蛋白再以电泳回收蛋白法纯化，参考文献4进行。5.抗体的制备及应用制备：将1mg纯化蛋白与弗氏完全佐剂混匀，充分乳化后，皮下接种于新西兰兔足蹼，2周后同样方法加强免疫一次, 再隔一周追加免疫一次。iNOS抗体检测TNF诱导小鼠巨噬细胞中的iNOS：小鼠腹腔注射TNF 48小时后，取腹水,分离得巨噬细胞后加入50l缓冲液A(20mmol/L T

9、ris-HCl,pH7.4, 2mmol/L EDTA) 重悬5，于液氮中反复冻融，离得上清进行电泳，作常规Western blot分析。结果1.iNOS（1196AA) 蛋白片段编码基因的克隆及重组表达质粒的构建： 以特异性引物1： 5-CCGAATTCATATGGCAAGCCCGTGGAAG-3, 引物2：5-GCGGATCCTCTATTAGCGATGCAGCCAG-3 ,以pCMV/iNOS 为模板，扩增得到约0.6kb的特异性片段，将扩增片段以 Nde、BamH双酶切，电泳回收后与相同酶切的表达质粒pET-28a(+)的DNA进行连接反应，转化入BL21菌株，经筛选得到重组质粒，DNA

10、测序证明为正确重组质粒（资料未列出），命名为pET-iNOSN196。2.iNOS蛋白片段的表达及确证：含重组质粒的表达工程菌经IPTG（isopropylthio-b-D-galactosid-e）诱导后，可见2条明显的额外蛋白带，相对分子质量分别约为27×103和20×103，见1。 2条蛋白带的表达量均占菌体总蛋白的15%20%，经Western blot 验证，2条额外带均可与iNOS抗体（美国西南医学中心提供）特异性结合，故均为iNOS片段，其中27×103蛋白相对分子质量与理论计算值基本一致，而20×103蛋白可能为降解产物，其相对于27&#

11、215;103蛋白缺少N端部分, 不能与His.BindTM柱结合（另文发表）。1iNOS N端蛋白在BL21中的表达、纯化Fig 1. SDS-PAGE of expression and purification of iNOS N-terminal fusion proteinLane a: protein molecular weight marker;lane b: uninduced;lane c: IPTG induced;lane d: purification by His.BindTM column;lane e: purified protein3. iNOS蛋白片段的纯

12、化: 表达工程菌经诱导产生的27×103蛋白为含iNOS N端及pET-28a(+)载体部分序列的融合蛋白，在pET-28a(+)部分有-His.tag序列(含6个连续的组氨酸)，因此采用His.BindTM (含Ni2+)亲和层析的方法纯化重组蛋白，该法纯化后的蛋白纯度可达90%。为得到更纯的蛋白作为免疫抗原或用于特异性抑制肽，采用电泳回收的方法得到高纯度的纯化蛋白，见1。4. iNOS抗体制备、活性鉴定及应用: 用电泳纯级的iNOS N端片段免疫家兔，获得抗血清，以常规间接ELISA法测定抗体的滴度。抗体稀释度分别为11000、 12000、 14000、 18000、11600

13、0、132000时，测定A492吸光度值，各稀释度抗体与对照的比值(P/N)分别为6.3、5.4、4.5、3.8、2.8、2.0，因此该抗血清的工作浓度初步定为116000。为观察iNOS抗血清与nNOS和eNOS的交叉反应，分别将3种NOS标准品进行SDS-PAGE，转移至硝酸纤维素膜后，进行Western blot分析，结果表明此抗血清只与iNOS特异性结合，而与 nNOS、eNOS 无交叉反应，与使用美国西南医学中心提供的iNOS抗体所得结果完全一致(如2)。以2种抗体检测iNOS标准品均得到相对分子质量131×103及另一约90×103的蛋白带, 90×1

14、03蛋白可能为131×103蛋白的降解产物。2iNOS抗血清与NOS同工酶的反应测定Fig 2. Cross reaction detection for anti-iNOS antiserum with NOS isoformLane a: nNOS standard protein;lane b: iNOS standard protein;lane c: eNOS standard proteinA. antibody against iNOS ( supplied by UT Southwestern Medical Center,USA)B. antiserum again

15、st iNOS(1-196AA)3只小鼠分别以25000U、50000U、100000U TNF诱导48小时后，取腹腔巨噬细胞，缓冲液A中反复冻融后，以所制备iNOS抗血清进行Western blot 检测, 发现3只小鼠巨噬细胞中均有iNOS表达，且具有一定的剂量依赖关系，如3, 而以正常血清检测则无此阳性条带出现。3小鼠巨噬细胞iNOS的Western blot分析Fig 3. Western blot analysis of iNOS in murine macrophagesLane a: control ;lane b: ip.25 000U TNF ;lane c: ip.50 0

16、00U TNF;lane d: ip.1 000 000U TNF讨论iNOS与cNOS不同，其在生理情况下不表达，但当一些细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、组织中的免疫细胞和胰岛细胞等6，受到LPS等因子的作用时，可被激活而表达iNOS mRNA，再翻译成iNOS，其催化产生的NO是巨噬细胞杀伤肿瘤细胞和病原微生物的主要物质，其过量表达与许多疾病的病理生理学有关，以iNOS 抗体进行Western blot分析及免疫组化分析将对许多疾病的病理学研究具有重要意义。国外曾采用全长iNOS作为抗原制备得到了特异性抗体7。从真核细胞中提取iNOS作为抗原，耗费巨大，而将全长iNOS cDNA装入原核表达载

17、体，因外源基因过长，表达量很低，故我们采用iNOS N端与cNOS同源性较低片段装入原核表达载体pET-28a(+)，既可获得较高的表达量，又利于所表达的融合蛋白的纯化（使用His.BindTM纯化含His.tag序列的蛋白）。我们将经两步纯化法制得的重组蛋白用于制备iNOS特异性抗体，取得了令人满意的效果。本实验发现,当以IPTG诱导表达工程菌时，产生了相对分子质量为27×103和20×103两种不同大小的额外蛋白带，这在原核表达中是不多见的。经考察两种蛋白均为iNOS片段， 所不同的是20×103蛋白较27×103蛋白缺少N端部分无pET-28a(+

18、)中的His.tag序列，不与His.BindTM柱结合，认为可能是在酶的作用下产生了N端降解，具体原因还有待继续研究。因越靠近N端，iNOS与cNOS的同源性越低，因此只纯化27×103蛋白作为抗原制备iNOS抗体。志谢：本研究在完成过程中得到美国西南医学中心James T Stull教授、智钢博士及Kim S Lau博士在质粒、试剂、抗体的提供及抗体鉴定方面给予的大力帮助，特此感谢。本课题受全军医药卫生科研基金和国家自然科学基金资助(项目编号：39670856 )作者单位： 210002 南京，南京军区军事医学研究所（潘英，朱敏生，沈月，许祥裕，朱有华,陈强）；中国药科大学（朱东

19、亚 ）参考文献1Nathan C, Xie QW. Nitric oxide synthases: roles,tolls,and controls. Cell, 1994, 78 915-918.2Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis TM. Molecular Cloning a laboratory Manual.2nd.Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.3姜泊，张亚历，周殿元主编.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996，15-22.4Hager DA，Burgess RR. Elution of protein from SDS-PAGE gel,removel of SDS, and renaturation of enzymatic activity: Results with sigma