miRNA在肿瘤的异常表达和转录调控机制

1、miRNA在肿瘤的异常表达和转录调控机制摘要：后基因组学时代，除了继续研究编码蛋白的功能基因之外，人们越来越多地关注对基因发挥调控作用的ncRNA类分子。在ncRNA这个大家族中，miRNA是人们关注的最热点之一。首先，miRNA拥有特殊的转录后调控机制，加上其本身的时空特异性表达，使得它们可以参与到生物正常生长发育的任何一个阶段，发挥它们的组调作用。其次，在肿瘤组织中miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。不仅如此，一些报道还证明miRNA可以稳定的存在于外周循环血中。由于miRNA的表达存在组织特异性，它们有可能成为新兴的肿瘤标志物分子。再次，miRNA并不是终极调控者，它们的表达还

2、受到不同分子水平的调控作用，其中表观遗传的调控机制尤为重要。本篇以miRNA本身的生物学作用为基础，总结阐述对目前已发现的miRNA在肿瘤中的异常表达和调控机制，并简要总结了一些可能成为肿瘤标志物的miRNA分子。关键词：miRNA、组调、甲基化、肿瘤分子标志物一、miRNA简介1.1 ncRNA的分类当人类基因组计划完成结构基因组测定的任务后，人们发现编码蛋白质的mRNA仅占基因组的很少一部分，在基因组中有相当多的非编码RNA (ncRNA)存在。虽然最初人们把它们视为进化后的冗余，但是现代的普遍观点认为，它们可能会在基因的表达调控中起非常重要的作用。ncRNA属于表观遗传学的范畴，它们和D

3、NA甲基化，组蛋白密码以及染色质重塑一起来决定基因的时空特异性表达。它们的成员中有我们先前所熟知的tRNA，rRNA等，但是除此之外其它ncRNA的功能大多还不为人知。随着对它们研究的深入，我们目前已经发现和命名的ncRNA大致可以分为lncRNA（long ncRNA）和sncRNA (small ncRNA)。目前研究的较多的是sncRNA，包括：miRNA (20-22bp), siRNA (21-25bp), snRNA (100-300bp), snoRNA, tRNA (75-95bp), piRNA (24-32bp)等。在众多sncRNA中miRNA是目前研究的最热点之一（图1

4、）。图1：表观遗传学与ncRNA表观遗传学研究包括DNA甲基化，组蛋白密码，染色体重塑，还包括ncRNA分子，ncRNA分子中有lncRNA和sncRNA两大类。sncRNA又可以细分为tRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snRNA, snoRNA, piRNA等。1.2 miRNA的发现miRNA中的lin-4，最先由Victor Ambros 研究组于1993年在秀丽隐杆线虫中发现1，并于2001年将同类分子命名为现在的名字miRNA2。这类分子通过目前已知的负反馈调控作用，参与许多的生物学过程，比如：发育，分化以及增殖等3。目前，人们已经发现了700多种miRNA的存在，

5、并且建立了许多miRNA数据库以方便我们查寻它们的相关信息，比如：miRbase、miRNAMap、miRDB等。此外，UCSC、NCBI等数据库也在不断地更新miRNA的基本信息，并与上述miRNA专用数据库实现信息互通，使得miRNA的信息不断地丰富了起来。1.3 miRNA的生成过程和作用机制miRNA需要经过一系列加工过程才会成熟，首先它们转录为比较长的分子，可以达到几个kb（pri-miRNA）。它们在核内由识别双链RNA的核酸内切酶Drosha切割成70-100bp的发卡结构4。呈发卡结构的pre-miRNA通过exportin 5转运出核，然后再经过识别双链RNA的核酸内切酶Di

6、cer切割，形成成熟的miRNA5。单链的miRNA加入RNA诱导的沉默复合物（RICS）特异的结合信使RNA (mRNA)的3非翻译区（3-UTR），但它们匹配程度是不完全的。mRNA和miRNA杂合双链通过5帽子机制影响翻译的启动6, 7，或者通过加速mRNA的降解来抑制翻译8。（图2）图2：miRNA生成过程和作用机制9miRNA基因经过转录生成pri-miRNA，在核内由Drosha剪切生成pre-miRNA，在Exportin5的帮助下转运出核，在胞浆中经Dicer的进一步剪切变成成熟的miRNA。miRNA可以剪切内源性的mRNA，也可以抑制mRNA的翻译。二、miRNA在正常生长

7、发育过程中的基因组调作用机体正常生长发育都源自胚胎干细胞。胚胎干细胞是一群具有特殊意义的细胞，它们具有两个非常重要的能力，即自我更新和多向分化10。自我更新意味着胚胎干细胞可以无限的分裂而不会走向衰老，多向分化意味着干细胞可以在体内或体外的适宜条件下向不同组织类型的细胞分化11。与此相对应，必定有一组基因共同协作参与干细胞的自我更新能力的维持，也必然有不同的基因组合参与调控干细胞走向分化的不同组织和不同阶段。那么这些参与干细胞功能的一系列基因为什么可以默契地在特定的阶段同时表达呢？是否存在某种机制来调控它们的组合？对于这一点，miRNA也许可以为我们做出解释。由于miRNA的靶点是保守的3-U

8、TR区，因此估计20%-30%的人类基因是miRNA的靶基因，而且每个miRNA存在着上百个携带对应保守序列的靶基因12, 13。这使得miRNA可以发挥牵一发而动全身的作用，也就是说miRNA可以对基因发挥组调作用。其一，某些miRNA可以决定干细胞功能的维持和分化的方向。miRNA与机体生长发育的关系研究源于对线虫中Let-7和Lin-4的认识，它们共同调节控制线虫幼体的发育14。在人类，很多研究者对miRNA参与的生长发育的调节机制方面也进行了各种探索和发现。例如： miR-371/372/373/373*基因簇是人类胚胎干细胞特异的miRNAs14。红系造血祖细胞（HSC）和外周血单核

9、细胞拥有不同的miRNA表达谱，即在红系造血祖细胞中上调表达的miRNA是miR-126, miR-10a, miR-221和miR-17-92基因簇；外周血单核细胞中上调表达的miRNA包括miR-142-3p，miR-218, miR-21, miR-37915。Liao等在人类造血干细胞的研究发现，miR-520h通过靶向抑制维持干细胞的因子ABCG2的表达而促进造血干细胞的分化16。Chen等报道miR-181的表达可以确立B-淋巴细胞的身份17。miR-9和miR-124a在脑发育的过程中的过表达可以减少星形胶质细胞的数量，反之则可以减少神经元细胞的数量18。miR-124可以调节可

10、变剪切和转录通路促进神经发育19-21。Let-7也在神经细胞特化过程中表达22。miR-206在鼠肌细胞中富集，可能是获得和维持分化状态所必需的23。当然，不同的miRNA涉及不同组织的终末分化，凡此种种，不胜枚举。更令人感兴趣的可能是上述提到的miRNA的基因组调作用。Ren等研究人类干细胞分化发育的过程中发现了两个基因簇，即miR-302基因簇和miR-520基因簇，它们分别定位在4号和19号染色体，并在未分化的干细胞中高表达24。有趣的是，他们对上述两个基因簇的靶基因进行了预测，发现它们共享同一种7碱基的保守种子序列，它们所调控的基因的功能可能相互叠加。大约有2284个共同的靶基因，分

11、别参与到细胞生长，细胞代谢，转录调控和小G蛋白参与的信号转导通路24。这种多靶基因调控现象体现了miRNA的广泛的基因组调作用。它们协调了生长发育的各种因素，促进发育的正常进行，此其二。三、miRNA在肿瘤的异常表达基于miRNA对细胞正常生长发育调控认识的前提，我们可以发现和认识肿瘤细胞中miRNA发生的异常表达现象。miR-21是新近报道较多的明星分子。很多临床病例资源的研究揭示，它在多种肿瘤（如：乳腺癌25，结肠癌26，食管癌27，肺癌28, 29，淋巴瘤30，胰腺癌31以及头颈部肿瘤32, 33）当中均呈高表达状态，并且它们的高表达与癌症的预后呈负相关，是独立的癌症预后因素之一。Let

12、-7 家族成员的角色则与此相反，其家族的成员在肿瘤中的表达普遍降低。在多种肿瘤（如：肺癌34-36，卵巢癌37-39，胃癌40，头颈部肿瘤41）等的病例研究报道的结果认为Let-7家族成员低表达与癌症预后呈负相关。当然，肿瘤的发生发展不仅仅是单一的miRNA分子决定的。miRNA在不同的肿瘤当中呈现不同的表达谱。Annika Schaefer等研究前列腺癌的miRNA表达谱时发现十种miRNAs (miR-16, miR-31, miR-125b, miR-145, miR-149, miR-181b, miR-184, miR-205, miR-221, miR-222)下调表达，而另外五种

13、miRNAs（miR-96, miR-182, miR-182*, miR-183, miR-375）则上调表达42。Nikiforova MN等研究报道了一组miRNA（miR-187, miR-221, miR-222, miR-146b, miR-155, miR-224和 miR-197) 在不同的甲状腺癌组织过表达，对甲状腺癌的诊断准确率达到95%43。miRNA不仅在肿瘤组织中发生变化，它们还可以在血浆当中稳定的存在。它们可能会成为新兴的肿瘤生物标志物分子。例如：Mitchel等研究了血浆中的miRNA表达情况，发现血浆中的miRNA可以免受内源性RNA酶的降解而稳定的存在，并且容

14、易被检测到44。在他们的研究报道中发现miR-141在前列腺癌的病人血浆中特异的高表达44。HO等研究报道了循环血中的miR-210可以作为胰腺癌乏氧的标志物45。Tsujiura等研究报道了胃癌血浆中的miR-17-5p, miR-21, miR-106a, miR-106b 高表达而 let-7a则低表达。但是术后，则发现上述的miRNA表达趋势发生了逆转46。而我们前述提到的miR-21在弥漫大B细胞淋巴瘤病人的血浆中高表达与癌症的无病生存期密切相关30。上述等等研究让人们感到欣喜的是，miRNA有可能成为新兴的肿瘤分子标志物。此外，很多的研究还报道了各种miRNA与癌症预后的关系，总结

15、如表1。表1.与癌症预后相关的miRNA表达改变miRNAs肿瘤类型表达变化和预后（样本数）参考文献let-7肺癌下调，预后差 (N=143)34肺癌下调，预后差(N=104 对)35鳞状细胞肺癌下调，预后差 (N=121)36卵巢癌下调，预后差 (N=214)37卵巢癌下调，预后差 (N=72+53)38 卵巢癌下调，预后差 (N=28)39头颈部肿瘤下调，预后差 (N=104)41胃癌下调，预后差 (N=353)40miR-15b黑色素瘤上调，预后差，易复发(N=128)47miR-18a结肠癌上调，预后差 (N=69)48卵巢癌上调，预后差 (N=28)39miR-21非小细胞肺癌上调，

16、预后差 (N=48对)28非小细胞肺癌上调，预后差(N=47 对)29头颈部肿瘤上调，预后差(N=169)32头颈部肿瘤上调，预后差(N=113)33鳞状细胞食管癌上调，预后差(N=170)27结肠癌上调，预后差(N=113)26乳腺癌上调，预后差(N=113)25胰腺癌上调, 肝转移 (N=56)31弥漫大B细胞淋巴瘤上调, 预后好(N=103)30miR-29c* (miR-29c)恶性胸膜间皮瘤上调, 预后好(N=142)49慢性淋巴细胞白血病下调，预后差(N=110)50miR-31结肠癌上调，进展期癌 (N=12对)51结肠癌下调，分化差 (N=35)52乳腺癌下调，转移增强 (N=

17、56)53miR-96前列腺癌上调，癌症复发 (N=79对)42miR-146b鳞状细胞肺癌上调，预后差 (N=71)54miR-155肺癌下调，预后差 (N=104对)35弥漫大B细胞淋巴瘤上调，较长无病生存期 (N=103)30miR-181a非小细胞肺癌上调，预后好(N=47 对)29miR-196a-2胰腺癌上调，预后差 (N=107)55miR-200 卵巢癌下调，预后差 (N=55)56卵巢癌上调，预后差 (N=28)39结肠癌上调，预后差 (N=24)57miR-205头颈部肿瘤下调，预后差 (N=104)41miR-210乳腺癌上调，预后差 (N=219)58miR-214 和

18、 miR-433胃癌上调，预后差 (N=353)40四、肿瘤中的miRNA转录调控异常既然miRNA在肿瘤的发生发展过程中发挥了很重要的作用，那么是什么因素在调控不同细胞中miRNA的表达呢？理论上，miRNA生成过程的任何一个环节都可以调控miRNA的表达。在基因水平上，miRNA的基因可以发生表观遗传修饰，包括CpG岛甲基化和组蛋白乙酰化或甲基化，从而导致miRNA的沉默;还可以伴随基因结构的改变（易位，扩增，缺失等）而改变。在转录水平上，miRNA与转录因子和转录抑制因子结合之间的动态平衡调控其转录速度；两种识别双链RNA的核酸内切酶的异常亦可以导致miRNA的表达变化（图3）。其中，表

19、观遗传机制在细胞miRNA表达谱的维持上可能有举足轻重的作用。对于这种表达谱的启动建立过程目前则所知甚少。图3：miRNA所接受的调控机制59miRNA在基因水平上可以接受表观遗传修饰调控，如：CpG甲基化，组蛋白修饰等。可以接受转录因子的调控，如myc、p53等。还可以伴随基因的改变而发生改变，如：易位，缺失，扩增等。调节它们成熟的两种核酸内切酶Drosha和Dicer 的异常也会导致miRNA的表达变化。4.1miRNA表达的表观遗传调控机制Langevin等研究了99例头颈部鳞状细胞癌及同等数量的对照，发现miR-137在肿瘤组织中高度甲基化60。在另外一个研究组中也发现了同样的变化，他

20、们在18种口腔癌细胞系中做了COBRA和克隆测序验证了miR-137 的甲基化61。同时得到验证的甲基化的miRNA还有miR-34a，miR-203，miR-193a61。除了在头颈部肿瘤的发现之外，Furuta等还研究报道了miR-124和miR-203在肝癌细胞系中发生了甲基化62。此外，Bueno等研究卵巢癌时发现miR-203的甲基化沉默导致其靶基因ABL1的过表达，促进了肿瘤的发生和发展63。另一项以214例卵巢上皮癌为研究对象的报道，提示Let-7a-3高度甲基化，影响了IGF-的表达进而影响肿瘤病人的生存率37。同样地，Brueckner等研究肺腺癌也报道了Let-7a-3的高

21、度甲基化64。此外，还有很多miRNA在癌症中发生了甲基化，总结见表2。表2：受表观遗传调控的miRNAmiRNA肿瘤种类参考文献Let-7a-3卵巢癌37miR-9-1乳腺癌，结肠癌65, 66miR-9-3乳腺癌67miR-124-1肝癌，胃癌62, 68miR-137头颈部肿瘤，结肠癌60, 61, 66miR-203头颈部肿瘤，卵巢癌61, 62, 64miR-193a头颈部肿瘤61miR-200a/200b/429膀胱癌，乳腺癌69, 70miR-34a/34b/34c卵巢癌,非小细胞肺癌71, 72miR-126原发泌尿系统肿瘤73miR-10a结肠癌74miR-1-1肝癌75mi

22、R-663乳腺癌65miR-152乳腺癌65miR-129-2胃癌76miR-107胰腺癌，慢性淋巴细胞性白血病77, 784.2miRNA表达的其他调控机制除了表观遗传的调控之外，还存在其他环节的调控。其一，基因重组对miRNA表达的调控，如：miR-15a/miR-16-1定位在13q14,该区在慢性淋巴细胞白血病中发生了缺失，而上述miRNA基因簇的靶分子是抗凋亡因子BCL-2。因此，BCL-2发生过表达使细胞出现恶性表型79。miR-29a和miR-29b定位在7q32，该区域在肌萎缩综合症以及急性髓细胞性白血病中发生了缺失。Let-7glet-7a1簇定位在3p2，let-7flet

23、-7d簇定位在9q22.3，let-7a-2定位在11q23-q24，let-7c定位在21q21，而且上述所有的区域都在许多癌症中发生了缺失，包括：肺癌，膀胱癌，乳腺癌，口腔癌，宫颈癌80。其二，转录因子对miRNA的调控作用，如：miR-34除了可以被甲基化调控之外，还可以被抑癌基因蛋白p53调控,而在多种肿瘤中p53可能会发生突变，因此，p53的异常可以导致miR-34的表达减弱81。与此相反的是miR-17-92基因簇,它们受到了癌基因蛋白c-myc的正性调控，即c-myc扩增可以导致miR-17-92基因簇的扩增表达82。此外，miR-10b受到了转录因子Twist的调控，由于Twi

24、st因子是促进肿瘤转移的重要转录因子，因此可以解释miR-10b促进肿瘤转移的现象83。其三，miRNA转录成熟异常，如：我们可以很自然的想到miRNA成熟过程中涉及的Dicer核酸内切酶异常对miRNA 的影响。值得一提的是，人们在最初研究miRNA与生长发育的关系时利用的研究手段主要是突变Dicer，使得miRNA不能成熟表达，导致小鼠胚胎细胞不能正常发育而死亡84。图4：人类癌症中涉及改变的miRNA在染色体上的定位80在人类癌症中涉及改变的miRNA在染色体上的定位。人类的24条染色体上miRNA基因的所在区域由星号显示（一个星号代表一种miRNA），许多miRNA的所在区域涉及到人类

25、癌症的重组热点区域80。五、小结与展望综上所述，miRNA不仅在机体的正常生长发育过程中发挥重要作用，也为我们更全面的认识和理解肿瘤的发生发展提供了可能。miRNA不仅在肿瘤组织中异常表达，也在外周循环血中稳定的存在。它们可能会在不久的将来成为新型的肿瘤生物标志物分子。另外，miRNA本身也受到不同分子水平的调控，包括表观遗传水平的调控，转录因子的调控，基因结构改变的影响以及miRNA成熟机制异常的影响。而其中，表观遗传的调控尤为重要，目前还需要更多的研究对该种调控机制进行阐述。随着对miRNA研究的不断深入，我们会更全面的认识肿瘤的发生发展机制，从而为临床治疗提供手段和依据。参考文献1.Le

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