Fos蛋白在血管加压素诱发急性心肌缺血大鼠脑内的分布

1、Fos蛋白在血管加压素诱发急性心肌缺血大鼠脑内的分布 【摘要】目的研究与急性心肌缺血功能有关的神经元在大鼠脑内的分布。方法股静脉注射血管加压素诱发大鼠急性心肌缺血，用免疫组织化学ABC法，观察Fos蛋白在脑内的表达和分布。结果Fos阳性产物分布于梨状皮质、伏核、终纹床核、扣带回、斜角带核、下丘脑室旁核、视上核、视交叉上核、弓状核、中央杏仁核、穹窿下器、丘脑室旁核、外侧缰核、中脑中央灰质腹外侧区、脑桥臂旁外侧核、蓝斑、延髓内脏带等脑区，而在大脑白质及小脑中无明显的密集分布区。结论心肌缺血诱发的Fos阳性神经元在大鼠脑内有着广泛的分布。【关键词】Fos蛋白；心肌缺血；血管加压素；免疫组织化学；大鼠

2、【中分类号】R322.81【文献标识码】A【文章编号】0529-1356(2000)04-296DISTRIBUTION OF FOS PROTEIN IN RAT BRAIN FOLLOWINGACUTE MYOCARDIOISCHEMIA INDUCED BY VASOPRESSINGE XuSU Chang-junRAO Zhi-renGAO Wen（Institute of Neurosciences,the Fourth Military Medical University,Xian 710032,China）【Abstract】Objective To investigate t

3、he distribution of functional neurons in rat brain following acute myocardioischemia. Methods The expression of Fos protein in rat brain following acute myocardioischemia induced by injecting vasopressin into vena femoralis was studied by the immunohistochemical ABC method. Results The Fos reactive

4、products were distributed in the piriform cortex,accumbens nucleus,bed nucleus of stria terminalis, cingulate gyrus,nucleus of diagonal band, hypothalamic paraventricular nucleus, supraoptic nucleus, suprachiasmatic nucleus, arcuate nucleus, central amygdaloid, subfornical organ, paraventricular tha

5、lamic nucleus, lateral habenular nucleus,ventrolateral part of the central gray,lateral parabrachial nucleus,locus ceruleus,medullary visceral zone.No extensively distribution of Fos protein was found in the white matter and the cerebellum. Conclusion The Fos reactive neurons were distributed extens

6、ively in the rat brain during acute myocardioischemia induced by intravenous injection of vasopressin.【Key words】 Fos; Myocardioischemia; Vasopressin; Immunohistochemistry;Rat早期即刻原癌基因c-fos被认为是神经元的一种“第三信使”，当细胞受到刺激时，第二信使进入胞核诱导c-fos基因转录mRNA，mRNA从胞核进入胞浆合成Fos蛋白，Fos蛋白与Jun蛋白结合形成二聚体，磷酸化并在AP-1的参与下进入胞核激活目的基因的

7、表达并最终对该刺激做出反应1。用原位杂交方法可观察胞浆内的mRNA，免疫组织化学方法则可显示胞核内的Fos蛋白，借以辨别与刺激有关的功能神经元，了解其生理功能和形态结构间的关系。Fos方法已成为目前最常用的机能形态学方法之一。心肌缺血是临床的常见病，严重者可发生心绞痛、心肌梗塞等病变，与高血压一起严重影响着人类的生存质量。尽管其诊断和治疗已有多种方案，且效果较好，但其神经调控机制仍不清楚，与其相关的功能系神经元分布亦缺乏详尽报道。本实验以股静脉注射血管加压素诱发急性心肌缺血的大鼠为动物模型，采用免疫组织化学方法，观察了Fos蛋白在脑中的分布。材料和方法1. 动物模型及切片制备雄性SD大鼠6只，

8、体重180250g，在温暖、避光、水和食物充足的环境中饲养1周后，乙醚吸入结合1%戊巴比妥钠(40mg/kg体重)腹腔麻醉以减少注射过程中因疼痛挣扎而出现的Fos表达，并记录心电(ECG)。暴露股静脉，分3次注入血管加压素，每次1U，间隔10min,再次记录ECG，并在动物存活2h后开胸，升主动脉插管。先以100ml生理盐水快速冲洗血液，随后用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)灌流固定，取出全脑置于20%蔗糖中至沉底。冰冻切片机切制连续冠状切片，片厚30m。2. 免疫组织化学染色按ABC法进行。切片入含0.3% Triton X-100的PBS中室温浸泡30min,

9、0.01mol/L PBS漂洗10min3次后，于兔抗Fos多克隆抗体(13 000,Santa Cruz)中4放置48h，PBS漂洗10min3次后入生物素结合的羊抗兔IgG(1500，Sigma)，室温放置2h，再次漂洗后移至Avidin-Biotin HRP Complex-ABC液(1500，Sigma)中室温2h，硫酸镍胺-葡萄糖氧化酶法呈色。常规贴片、脱水透明、DPX封片，光镜观察。3. 对照实验3.1麻醉对照组：SD大鼠4只，乙醚吸入麻醉后，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg体重)，不手术，不注射血管加压素，2h后同前灌流固定、取材、进行Fos免疫组织化学反应。3.2生理盐水

10、对照组：SD大鼠4只，乙醚-戊巴比妥钠复合麻醉下，生理盐水替代血管加压素以同等方式、同等剂量注入股静脉，测量ECG，其后步骤同实验组。3.3免疫组织化学法对照：用PBS取代兔抗Fos多克隆抗体，将部分实验组切片孵育48h(4)，其他步骤同实验组。结果文中所用核团的中英文名称参照王平宇等的研究2。1. 心电改变实验组注射血管加压素前心电无明显改变(1a)：注射后，心电示ST-T段持续改变，提示心肌缺血，且心率增快(1b)。生理盐水对照组心电无缺血改变。 1a注射血管加压素前大鼠的心电；1b注射血管加压素后大鼠的心电，示心肌缺血Fig.1a Electrocardiogram(ECG) of th

11、e rat without being injected the vasopressin; 1b,ECG of the rat being injected the vasopressin indicated myocardioischemia.2. Fos阳性胞核分布在血管加压素诱发急性心肌缺血情况下，Fos阳性胞核见于大鼠脑内多个核团和区域(2)，现分述如下：2.1大脑：嗅脑内Fos阳性细胞主要出现在小球层和僧帽细胞层，此外髓层中也有较密集的分布。皮质区除扣带回、梨状皮质有Fos阳性细胞中度密集的分布外，其余皮质均很稀少。此外，伏核、终纹床核(3)、斜角带核(4)、Calleja岛、杏仁核

12、簇，尤其是中央杏仁核(5)、穹窿下器周缘(6)皆有密集分布。2.2间脑：下丘脑区域Fos阳性产物密集于下丘脑室旁核(7)、视上核(8)、视交叉上核(9)、弓状核(10)和正中隆起。第三脑室室周灰质、下丘脑视前外侧区和外侧区也有Fos阳性细胞的中度密集分布。丘脑室旁核、外侧缰核(11)Fos分布密集。2.3小脑：急性心肌缺血时，大鼠小脑内Fos阳性产物无明显分布密集区。 2.4脑干：中脑中央灰质的腹外侧区(12)、中缝背核Fos阳性产物中度密集。脑桥臂旁外侧核、蓝斑(13)和A5区有高度密集的Fos分布，背侧背盖区中度密集，前庭核簇、中缝核群也有少量分布。Fos阳性产物在延髓内的分布极具规律性，

13、密集区形成一条背内腹外方向伸展的弧形带，称为延髓内脏带(MVZ)。具体包括：背内侧的孤束核、迷走神经背核、最后区、腹外侧的腹外侧网状核以及位于两者之间的中间带等(14)。值得注意的是在MVZ中间部Fos阳性胞核多位于疑核内侧。此外，三叉神经旁核、下橄榄内侧核帽也有中等程度的Fos表达。3. 实验组和对照组不同核团中Fos阳性产物的定量比较(附表)从表中数据可看出，除嗅脑外，实验组和对照组Fos阳性胞核在大鼠脑内不同核团中的数量有显著的差异。附表Fos阳性产物在实验组及对照组大鼠脑内不同核团中的分布Table Distribution of the Fos positive reactive p

14、roducts in the rat brains of the experimental group and the control groups实验组experimentalgroup麻醉对照anesthesiagroup盐水对照salinegroup实验组experimentalgroup麻醉对照anesthesiagroup盐水对照salinegroup嗅脑rhinencephalon532510547外侧缰核lateral habenular nucleus752012梨状皮质 piriform cortex633141外侧臂旁核 lateral parabrachial nucle

15、us2242136扣带回cingulum gyrus1093743中央灰质腹外侧区ventrolateral part of the central gray952025终纹床核bed nucleus of stria terminals45517蓝斑locus ceruleus901644斜角带nucleus of diagonal band3165692中缝背核dorsal raphe nucleus4534中央杏仁核central amygdaloid9037最后区area postrema2652015穹窿下器subfornical organ121921孤束核nucleus of s

16、olitary tract76870260视上核supraoptic nucleus1684032中间带intermediate reticular zone551015视交叉上核suprachiasmatic nucleus80617疑核nucleus ambiguus1535下丘脑室旁核hypothalamic paraventricular nucleus763026腹外侧网状核ventrolateral reticular nucleus751025 讨论血管加压素是一种九肽，由下丘脑室旁核和视上核神经元分泌，经下丘脑垂体束被运输到垂体后叶，并作为垂体后叶激素释放入血。起初人们以为血管

17、加压素的生理功能是促进肾脏对水的重吸收，故称之为抗利尿激素。但后来知道它对心血管活动也起重要的调节作用。由于血管加压素的作用主要针对内脏小动脉，且一般不能通过血脑屏障，故可以排除其直接作用于中枢神经系统的影响。心脏是对缺血最敏感的器官，本实验从股静脉注入血管加压素3，引起大鼠冠状动脉等血管的痉挛，造成急性心肌供血不足，加之外周阻力增加，导致心脏负荷加重，直接表现为心电的缺血改变。这种来自心脏的缺血信息很快传入中枢，在中枢神经系统经过一系列的整合与调节，产生相应的应激反应。这种整合及调节的过程非常复杂，由多级中枢共同参与。Fos方法自80年代建立以来，已广泛用于显示某一刺激传导的神经通路46，虽

18、然其结果是通过形态学方法显示，但在某种程度上反映了一定的功能意义，因而被认为是一种形态与功能相结合的指标3。在使用Fos法时，我们除严格限制实验条件外，还设立了严格的对照，以保证结果的特异性。对于嗅脑Fos分布在实验组和对照组无明显差异的结果，我们认为与乙醚吸入麻醉有关，嗅皮质对急性心肌缺血似无直接反应。Dun7在研究心血管反应相关神经元时发现：失血刺激下，Fos阳性产物见于梨状皮质、终纹床核、Calleja核、穹窿下器、杏仁中央核、臂旁核、室旁核、视上核、脑桥A5区、延髓腹外侧部、孤束核、最后区以及脊髓中间带外侧核等；而高血压条件下，则主要密集于终纹床核、杏仁中央核、臂旁核、孤束核和最后区。

19、Vahid-Ansari8的研究则表明：急性心肌梗死引起的充血性心力衰竭在发生24周后Fos相关基因样(Fra-LI)物质主要见于室旁核、视上核、孤束核、迷走神经背核、最后区，腹外侧的腹外侧网状核以及位于两者之间的中间带等核团。我们在血管加压素诱发急性心肌缺血状态下得到的实验结果基本上包括了以上核团，此外还证实了斜角带核、蓝斑、延髓中间网状等也参与心血管反应。根据以往的研究9推测，上述核团的反应不是彼此孤立，而是构成以延髓内脏带为中心的神经网络。来自内脏的刺激信息经迷走神经或交感神经的传入纤维直接或间接(经脊髓)传至延髓内脏带，延髓内脏带的相关神经元发出纤维直接10，11或间接12(经臂旁核、

20、中脑中央灰质换元)投射至前脑边缘系(梨状皮质、终纹床核、杏仁中央核等)和下丘脑13(室旁核、视上核等)。前脑边缘系和下丘脑也发出纤维直接或间接(经臂旁核、中脑中央灰质换元)投射至延髓内脏带，延髓内脏带也有纤维投射至脊髓中间带外侧核(交感神经节前神经元)或发出副交感节前纤维支配心脏。由此可见，当急性心肌缺血时，机体的应激反应是受到一个复杂的中枢神经网络的调节。本文314见插第3，4页3终纹床核内的Fos阳性神经元。BST.终纹床核LV.侧脑室400Fig.3 Fos-positive neurons in the bed nucleus of stria terminalis.BST, bed

21、nucleus or stria terminalis LV,lateral ventricle 4004斜角带核内的Fos阳性神经元。HDB.斜角带核水平部VDB.斜角带核垂直部160Fig.4 Fos-positive neurons in the nucleus of diagonal band.HDB,horizontal part of the nucleus of diagonal band VDB,vertical part of the nucleus of diagonal band 1605杏仁核簇内的Fos阳性神经元。OPT.视束CE.杏仁中央核160Fig.5 Fos-

22、positive neurons in the amygdaloid nuclei.OPT,optic tract CE,central amygdaloid nuclei 1606穹窿下器内的Fos阳性神经元。SFO.穹窿下器160Fig.6 Fos-positive neurons in the subfornical organ. SFO,subfornical organ 1607下丘脑室旁核的Fos阳性神经元。3V.第三脑室PA.下丘脑室旁核400Fig.7 Fos-positive neurons in the hypothalamic paraventricular nucleu

23、s.3V,3th ventrical PA,hypothalamic paraventricular nucleus 4008视上核内的Fos阳性神经元。OPT.视束SO.视上核160Fig.8 Fos-positive neurons in the supraoptic nucleus.OPT,optic tract SO,supraoptic nucleus 1609视交叉上核的Fos阳性神经元。3V.第三脑室SCH.视交叉上核400Fig.9 Fos-positive neurons in the suprachiasmatic nucleus.3V,3th ventrical SCH,

24、suprachiasmatic nucleus 40010弓状核的Fos阳性神经元。ARC.弓状核160Fig.10 Fos-positive neurons in the arcuate nucleus.3V,3th ventrical ARC,arcuate nucleus 16011外侧缰核的Fos阳性神经元。3V.第三脑室LHB.外侧缰核160Fig.11 Fos-positive neurons in the lateral habenular nucleus.3V,3th ventrical LHB,lateral habenular nucleus 16012中脑中央灰质腹外侧区

25、的Fos阳性神经元。AQ.中脑导水管CGL.中脑中央灰质外侧区160Fig.12 Fos-positive neurons in the ventrolateral part of central gray.AQ,mesencephalic aqueduct CGL,lateral part of central gray 16013臂旁外侧核及蓝斑内的Fos阳性神经元。LC.蓝斑LPB.臂旁外侧核160Fig.13 Fos-positive neurons in the lateral parabrachial nucleus and locus ceruleus.LC,locus ceru

26、leus LHB,lateral parabrachial nucleus 16014延髓内脏带中的Fos阳性神经元。AP.最后区NTS.孤束核VLRT.腹外侧网状核80Fig.14 Fos-positive neurons in the medullary visceral zone.AP,area postrema. NTS,nucleus of solitary tract VLRT,ventrolateral reticular nucleus 80【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39770251)【作者简介】葛煦(1973)，男(汉族)，四川成都人，硕士葛煦（第四军医大学神经科

27、学研究所，西安710032）宿长军（第四军医大学神经科学研究所，西安710032）饶志仁（第四军医大学神经科学研究所，西安710032）高文（第四军医大学神经科学研究所，西安710032）参考文献1张遐，鞠躬.c-fos癌基因的诱发和显示一种反映神经功能通路的新方法J.生理科学进展，1991，22(4)：299303.2王平宇，张凤真.大鼠脑读片提要及谱M.西安：西北大学出版社，1995：223250.3徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法M.北京：人民卫生出版社，1982：713714.4DiNardo LA,Travers JB.Distribution of Fos-like immuno

28、reactivity in the medullary reticular formation of the rat after gustatory elicited ingestion and rejection behaviorsJ.J Neurosci,1997,17(10):3826-3839.5McKinley MJ,Colvill LM,Giles ME,et al.Distribution of Fos-immunoreactivity in rat brain following a dipsogenic dose of captopril and effects of angiotensin receptor blockadeJ.Brain Res,1997,747(1):43-51.6Carstens E,Saxe I,Ralph R.Brainstem neurons expressing c-fos immunoreactivity following irritant chemical stimulation of the rats tongueJ.Neuroscience,1995,69(3)