人参总皂苷和小檗碱对肺癌PG细胞分泌免疫抑制性细胞因子的影响

1、人参总皂苷和小檗碱对肺癌PG细胞分泌免疫抑制性细胞因子的影响 09-08-13 15:17:00 编辑：studa20 作者：郝钰, 王萍, 吴珺, 邱全瑛【摘要】 目的：观察人参总皂苷（ginsenoside, Gs）和小檗碱（berberine, Ber）对肿瘤细胞分泌免疫抑制性细胞因子转化生长因子1（transforming growth factorbeta1，TGF1）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的影响，探讨Gs和Ber对肿瘤免疫逃逸的作用机制。方法：首先建立人肺癌PG细胞与人T淋巴细胞株Jurkat细胞的共培养体系，随机分为Gs（100 g/ml）组

2、、Ber（10 g/ml）组、空白对照组和Jurkat组。用Gs和Ber作用PG细胞24 h后与Jurkat细胞共培养，24 h后倒置显微镜下观察Jurkat细胞生长的状态；台盼蓝拒染实验计数共培养6 h和24 h后Jurkat活细胞数；流式细胞仪检测共培养24 h后Jurkat细胞的凋亡率；100、50、25 g/ml的Gs和10、5、2.5 g/ml的Ber分别处理PG细胞，并设空白对照组（PG细胞未经药物处理），酶联免疫吸附测定法和放射免疫法检测PG细胞上清液TGF1和PGE2的含量。结果：Jurkat细胞与Gs和Ber处理过的PG细胞共培养后，其数目较空白对照组明显减少，而凋亡率较空白

3、对照组明显增加；Gs和Ber可以增加PG细胞TGF1的分泌，对PGE2的分泌无影响。结论：Gs和Ber可以增强PG细胞导致的Jurkat细胞生长抑制和凋亡，其机制可能与Gs和Ber增加PG细胞分泌TGF1有关。 【关键词】 人参皂苷类; 小檗碱; 抑制因子, 免疫; 转化生长因子1; 前列腺素E类Objective: To observe the effects of ginsenoside (Gs) and berberine (Ber), two kinds of active components of traditional Chinese herbal medicine, on tr

4、ansforming growth factorbeta1 (TGF1) and prostaglandin E2 (PGE2) in PG cells.Methods: Coculture system of human lung carcinoma cell line PG and human T lymphocyte cell line Jurkat was established. PG cells were treated with Gs (100 g/ml) and Ber (10 g/ml) for twentyfour hours, and then cocultured wi

5、th Jurkat cells. After 24hour coculture, the state of Jurkat cells was observed with inverted microscope. The viable count of Jurkat cells was detected by trypan blue staining after 6 and 24hour coculture, and the apoptosis of Jurkat cells was evaluated by flow cytometry. PG cells were treated with

6、100, 50, 25 g/ml Gs and 10, 5, 2.5 g/ml Ber respectively, and the content of TGF1 and PGE2 in PG cells was detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) and radioimmunoassay (RIA) method.Results: After coculture with PG cells treated with Gs and Ber, the number of Jurkat cells was less than b

7、lank control group, and the apoptosis rates of Jurkat cells in Gs and Bertreated groups were higher than blank control group. Gs and Ber could promote the secretion of TGF1 in PG cells, but could not change the level of PGE2.Conclusion: Gs and Ber can promote the growth inhibition and apoptosis of J

8、urkat cells induced by PG cells, which may be related to the upregulation of Gs and Ber on TGF1 secretion in PG cells.Keywords: ginsenosides; berberine; suppressor factors, immunologic; transforming growth factor 1; prostaglandins E肿瘤的免疫逃逸机制复杂，可以通过自身分子表达的改变，如肿瘤特异性抗原的缺失、主要组织相容性抗原复合物（major histocompab

9、ility complex, MHC）I类分子的缺乏、共刺激分子B7的缺陷、Fas分子下调耐受凋亡以及“Fas反击”和分泌免疫抑制性细胞因子等，使肿瘤不能有效地被免疫细胞识别和攻击，甚至主动下调宿主免疫功能，从而逃避抗肿瘤免疫反应。我们的前期研究结果表明，Jurkat细胞与PG细胞共培养后数目减少，人参总皂苷（ginsenoside, Gs）和小檗碱（berberine, Ber）可以促进PG细胞的这种作用，该结果可能与Gs和Ber增加PG细胞的FasL表达，促进PG细胞诱导Jurkat细胞凋亡的“Fas反击”作用有关。但Jurkat细胞与PG细胞共培养后数目减少的原因除与“Fas反击”诱导的

10、凋亡有关外，也有可能与PG细胞分泌某些免疫抑制性细胞因子相关。本研究检测了PG细胞分泌转化生长因子1（transforming growth factorbeta1，TGF1）和前列腺素E2（prostaglandin E2, PGE2）的情况以及Gs和Ber对此的影响。1 材料与方法1.1 细胞株 人高转移性肺癌细胞PG（本室保存）；人T淋巴细胞株Jurkat（中国医学科学院基础医学研究所）。1.2 药物与主要试剂 Gs（北京天然药物研究院赵锐博士惠赠）；Ber（中国药品生物制品检定所）；AnnexinV FITC细胞凋亡检测试剂盒（北京宝赛生物技术有限公司）；人TGF1检测试剂盒（武汉博士

11、德生物工程有限公司）；人PGE2放射免疫分析试剂盒（苏州大学血液学研究所）。1.3 药物剂量与分组 Gs 100 g/ml，Ber 10 g/ml。Gs、Ber分别处理PG细胞24 h，PBS缓冲液洗涤3次以洗去药液，消化离心后调整细胞浓度至2105/ml，接种于25 cm2培养瓶，同时设立未经药物处理的对照组（空白对照组）。待细胞贴壁后（融合至80左右），各组弃去培养液，各加入浓度为3105/ml的Jurkat细胞悬液10 ml铺于PG细胞之上进行共培养。实验共培养组分为3组：Gs组、Ber组和空白对照组，同时设立Jurkat细胞单独培养组（Jurkat组）。以上4组每组设3个样本。100、

12、50、25 g/ml的Gs和10、5、2.5 g/ml的Ber分别处理PG细胞24 h，弃去药液，冷PBS洗涤，离心重悬后各组用新鲜培养液调整至相同浓度，加入96孔培养板继续培养24 h（同时设立不用药PG细胞组），共7组，每组4个复孔。1.4 样本采集 Jurkat细胞与PG细胞共培养6 h和24 h后，小心振荡培养瓶，使黏附的Jurkat细胞尽量脱落，移出细胞悬液于离心管内；各共培养瓶内加入胰酶消化液（无乙二胺四乙酸），使黏附的Jurkat细胞进一步脱落，镜下观察，至Jurkat细胞基本脱落而PG细胞未脱离时为宜，移入先前移出的Jurkat细胞悬液离心管内，离心弃上清，收集细胞，供台盼蓝拒

13、染实验和凋亡检测用。收集不同浓度Gs和Ber分别处理过的PG细胞上清液，供TGF1和PGE2检测用。1.5 Jurkat细胞的生长状态观察 共培养24 h后，倒置显微镜下观察各组Jurkat细胞的生长情况。1.6 台盼蓝拒染实验检测Jurkat活细胞数 将共培养6 h和24 h后收集的Jurkat细胞调整至相同体积，台盼蓝拒染实验观察Jurkat活细胞数。1.7 流式细胞仪检测Jurkat细胞的凋亡 按试剂盒说明书步骤进行。1.8 酶联免疫吸附测定法和放射免疫法分别检测TGF1和PGE2含量 依据检测试剂盒的说明书进行检测。1.9 甲基噻唑基四唑法检测Gs和Ber对PG细胞增殖的后遗效应 采集

14、上清液后，运用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测PG细胞的增殖情况，以判断去除药物作用24 h后PG细胞数目的差异。1.10 统计学方法 用SPSS 11.0软件对数据进行分析处理，计量资料用xs表示，采用单因素方差分析并进行组间两两比较。2 结果2.1 Gs、Ber处理的PG细胞对Jurkat细胞生长状态的影响 倒置显微镜下可以观察到，培养24 h后，Jurkat细胞在单独培养的情况下，呈现成团生长现象，伴有散在细胞的生长，而共培养组Jurkat细胞均呈散在生长状态；共培养Gs组和Ber组Jurkat细胞的数目均较空白对照组少。见图1。

15、图1 Jurkat 细胞与Gs、Ber处理的PG细胞共培养24 h的生长状态（倒置显微镜，100）（略）Figure 1 Growth status of Jurkat cells cocultured with PG cells treated with Gs and Ber for 24 h (Inverted microscope, 100)A: Jurkat cells group (uncocultured control); B: Blank control group (cocultured with untreated PG cells); C: Gstreated group (cocultured with Gstreated PG cells); D: Bertreated group (cocultured with Bertreated PG cells).2