人肝癌组织中γ-谷氨酰转移酶异常表达及其基因甲基化程度的研究

1、人肝癌组织中-谷氨酰转移酶异常表达及其基因甲基化程度的研究【摘要】目的探讨-谷氨酰转移酶(GGT)基因在人类肝癌发生过程中的表达及改变机制。方法以病理组织学、生物化学和分子生物学方法，将自身配对的肝癌、癌旁组织和远癌组织中总RNA纯化，对GGT的表达与改变进行了分析；并设计两套引物，以逆转录巢式PCR法扩增GGT5-非编码区(NC)基因和限制性内切酶消化分析了不同肝癌组织中GGT基因的甲基化程度。结果在病理组织学证实的24例肝癌、癌旁和远癌组织中：从肝癌灶至远癌的不同组织中，总RNA浓度呈逐步升高趋势，三种不同组织间的差异均有显著性(P0.05);癌组织中总GGT比活性(U/g)较癌周和远癌组

2、织明显升高(P0.05);以自行设计建立的逆转录巢式PCR法，成功地扩增GGT的5-NC基因片段，特异性强且区带清晰，PCR产物经酶切分析证明，GGT基因5-NC M3位点(CCGG)，其内位C在癌灶、癌周和远癌组织中的低甲基化频率分别为70.83%,58.33%和54.17%，非常明显地高于同组中已甲基化程度。结论肝癌组织中GGT基因甲基化程度较低，且与肝癌GGT的异常表达关系密切，对肝细胞癌变可能起促进作用。【关键词】肝癌-谷氨酰转移酶基因表达RNA甲基化 Abnormal expression and methylation status of -glutamyl transferase

3、 (GGT) genes in human hepatoma tissueTANG Qiyun, YAO Dengfu, LIU Yanhua, et al. The First Hospital, Yancheng City of Jiangsu Prouince, 224001【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanisms of expression and alteration of -glutamyl transferase (GGT) genes during the development of human hepatic carcinom

4、a.MethodsThe total RNA concentration and the expressions and changs of different molecular forms of GGT in the self-controled liver cancerous, paracancerous and distal cancerous tissues were investigated by pathologic examination, biochemical and molecular biological assays. Moreover, the part GGT g

5、enes of the 5-NC region were amplified with two sets of primers by using a nest RT-PCR assay, and methylation status of GGT genes were also studied by a restriction endonuclease RT-PCR technique.ResultsOf the 24 tissue specimens confirmed by pathological examination: An increasing tendency of total

6、RNA concentrations was found from cancer to distal cancerous tissues, and there was a marked difference (P0.05) between those in liver cancers and paracancerous /or distal cancerous tissues; The specific activities (U/g) of total GGT was significantly higher (P0.05) in hepatoma tissues than in those

7、 of paracancerous/or distal cancerous tissues; Analysed by using a restriction endonuclease RT-PCR assay, the inner C of M3-CCGG-site of GGT 5-NC genes in their PCR products showed universal hypomethylation. The frequency of hypomethylated M3 site was 70.83% in hepatomas, 58.33% in paracancerous and

8、 54.17% in distal cancerous tissues and was significantly higher than that of the M3 site methylated cases in the same group.ConclusionsThe hypomethylation status of GGT genes in hepatomas is strongly correlated with the abnormal expression of hepatoma GGT and hypomethylated GGT gene might promote t

9、he liver canceration during hepatocarcinogenesis.【Key words】Hepatoma-GGTGeneExpressionRNAMethylation体内-谷氨酰转移酶(GGT)既与生物转化、核酸代谢及肿瘤发生有密切关系，又是反映肝细胞恶性病变的灵敏标志酶1，2。GGT在胚胎期以肝内最多，出生后逐步降至较低水平；当肝细胞发生癌变时，肝内GGT重新大量表达，并且出现较明显的异质性改变。已知肝细胞癌变过程中，总基因组DNA甲基化水平、部分癌基因及癌相关基因如c-fos等呈低甲基化状态，DNA胞嘧啶残基的甲基化，特别是CCGG序列内位C甲基化状态与基

10、因的调控和表达有密切关系3，4，但GGT基因甲基化状态与肝癌发生之间有何关系尚不清楚。本研究通过分析人肝癌组织中总RNA浓度、酶蛋白表达和对GGT基因进行扩增观察其甲基化程度，试从分子水平来探讨细胞癌变机制。材料与方法一、研究对象收集1997年7月1998年4月外科手术新鲜肝组织标本，标本来自南通医学院附属医院及江苏省盐城市第一、第二人民医院，分别留取肝癌组织、癌周组织及远癌组织各24份，各约200mg，取部分肝组织作病理学检查(H.E染色)，其余置于85C冰箱保存，留作提取总RNA、GGT非编码区基因扩增以及GGT酶蛋白的制备。二、肝GGT酶蛋白提取与浓度分析称取肝癌组织、癌旁和远癌组织湿重

11、50mg，以含0.5%Triton X-100的匀浆液置冰水浴中，高速匀浆后置于4C过夜，在高速冷冻离心机上，以15 000r/分离心45分钟，留上清液于20C备用。以-谷氨酰对硝基苯胺直接法，分析上清液中GGT活力(U/L)，并以福林-酚试剂法测其蛋白浓度(g/L)，并计算出酶比活性单位(U/g)。三、肝组织总RNA制备与浓度精确称取肝组织50mg，置于无RNAase匀浆器中，加入RNAzole 1.0ml匀浆2分钟，再按Okamoto等5方法提取总RNA，加入TE缓冲液100l，取部分RNA于UV-2201型紫外分光光度计上测A260，换算出总RNA浓度(g/mg组织)。经紫外分光扫描鉴定

12、，纯化的RNA未受到污染和降解。其余RNA置于85C保存备用。四、引物设置及逆转录巢式PCR扩增以肝癌细胞株GGT核苷酸序列5设计巢式PCR扩增引物(1)，由中科院上海细胞所合成。设计扩增序列位于GGT5-非编码区，含有CCGG的M3位点(409bp处)。肝GGT-RNA先经随机引物和逆转录酶合成cDNA，再以此为模板在PE480型DNA扩增仪上进行巢式PCR扩增，每次扩增35个循环。第一阶段PCR以外部引物(GT-1,5-CTCCATTCGTAGACCACCTC-3;GT-2,5-TAGGTTAGACTGTGGGCAGG-3)和cDNA为模板，扩增产物为400bp；第二阶段PCR，以扩增的P

13、CR产物为模板和内部引物(GT-3，5-TGTCTGCCTCTGAGGTCAGA-3；GT-4，5-CAGGTCTCTTGCTCACTGTA-3)进行扩增，最终PCR产物280bp。作定性检测并存于85C留作甲基化分析。1GGT部分基因及其扩增位置示意五、GGT M3位点甲基化程度分析将GGT-RNA逆转录合成GGT-cDNA，再按上述第一阶段PCR步骤扩增，扩增结束后取产物5l，加入Hap10U与双倍体积Hap缓冲液混匀，37C作用4小时，经2%琼脂糖凝胶电泳，在透射紫外光照射下，与标准DNA比较判别GGT的M3位点是否已甲基化。PCR产物经酶消化后，若出现与原设计一致的322bp和78bp

14、片段，则表示GGT该段基因未甲基化；PCR产物经酶消化后，被扩增的基因片段仍表现为400bp，说明限制性内切酶Hap不能消化该位点，则表示GGT的基因已甲基化；PCR产物经酶消化后无特异性DNA片段出现，则表示该段基因不能扩增。结果一、肝癌组织的病理学检查手术后的新鲜肝组织作病理检查，按自身对照原则分三组：(1) 癌组：包括20例原发性肝癌(PHC)，4例系转移性肝癌(来自胃癌2例，胰腺癌1例，乳腺癌1例)；(2)癌旁组：组织学显示肝硬化17例，慢性肝炎3例，伴不典型增生16例；(3) 远癌组：肝硬化11例，慢性肝炎9例，伴不典型增生者11例；地衣红染色示HBV阳性者19例。二、肝总RNA浓度

15、与GGT比活性变化不同肝组织中总RNA浓度和总GGT比活性(T)变化，见表1。组织中总RNA浓度，肝癌组织明显较癌周和远癌组织低(P0.05)，肝癌组织中总GGT比活性非常明显地高于癌周和远癌组织(P0.01)。表1肝组织总RNA及T-GGT比活性变化(s)组别例数总RNA(U/mg)肝匀浆T-GGT(U/g)肝癌2421.1130.84100.6087.43癌周2439.9831.45*51.6121.71*远癌2453.8450.50*46.6116.42*与肝癌组织比较*P0.05*P0.05)，但各组内未甲基化例与甲基化例的比较均差异有非常显著性(P0.001)；各组中GGT基因未检出

16、例，均系表1中RT-PCR未扩增出特异性阳性区带的肝组织。表2RT-PCR扩增产物Hap酶切消化结果组织例数甲基化(%)未甲基化(%)未确定(%)肝癌246(25.00)17(70.83)*1(4.17)癌周247(29.17)14(58.33)*3(12.50)远癌246(25.00)13(54.17)*5(20.83)与甲基化例比较：*P0.001,*P0.025,*P0.05 讨论肝组织癌变时能合成和分泌多种与肝癌相关的蛋白质、多肽或同工酶，如AFP和GGT-等1，2，为了解肝癌GGT的产生与机制，本文研究了24例人肝癌癌组织、癌旁组织、远癌组织中GGT的表达与改变。经病理学检查，肝癌的

17、远癌组织以肝细胞变性为主，癌周组织以肝硬化为主，大多数组织(19例)伴有乙肝病毒感染，符合人类肝癌的多阶段过程。肝癌组织总GGT比活性高于癌周及远癌组织(P0.05)，说明GGT在肝癌、癌周组织呈过量表达趋势。癌周及远癌组织GGT比活性比较差异无显著性，系由于癌周和远癌组织多伴不同程度的肝炎、肝硬化，只是病变程度不同而已，未形成癌的质的变化。肝癌的发生与DNA合成及核酸代谢旺盛密切相关6，7，但本组病例肝组织总RNA浓度，在各组间的差异有显著性(P0.05)，且与GGT活性增加呈相反的变化，可能与人肝癌发生经过不同程度肝炎、肝硬化到肝癌长达数十年的发病过程，其中包括肝细胞坏死、结节样增生、假小

18、叶形成、大量的纤维结缔组织代替正常肝细胞使肿瘤组织残存肝细胞减少，同时伴肿瘤组织出血、坏死，则表现为有形细胞成分减少，组织总RNA减少，其复杂机制有待进一步阐明。GGT基因5-NC区由744个核苷酸组成(含6个CCGG位点)，M3位点的甲基化状态如何尚不清楚。通过该项研究，发现在M3位点存在广泛的低甲基化，肝癌、癌周、远癌组织低甲基化频率分别为70.83%、58.33%和54.17%，组间差异无显著性，似乎与GGT活性有同向变化关系，提示GGT基因低甲基化诱导GGT表达，导致肝组织和血中GGT活性升高。Suzuki等8认为，对LEC大鼠使用低甲基化5-杂氮胞嘧啶(5-aza)，使LEC大鼠5-

19、甲基胞嘧啶含量明显的减少，同时鼠GGT大量表达，最终使该组大鼠发生肝肿瘤，而对照组未发生这种变化，说明肝细胞对低甲基化药物高度敏感，且DNA甲基化 减少在其发展为肝炎或肝肿瘤中起一定的作用。Baik等9以5-aza作用于高度甲基化的Fao细胞，在引起脱甲基化作用的同时，出现GGT强烈而稳定的表达，认为去甲基化增加GGT基因的表达。本组病例中，5例癌组织GGT基因M3位点发生甲基化，其中1例伴有癌旁组织M3位点甲基化，2例伴癌旁、远癌组织该位点甲基化，另2例(胃癌肝转移1例)均不伴有癌旁、远癌组织该位点甲基化，提示肝癌时GGT基因甲基化类型存在着异质性10。本研究仅为初步认识，但有关人类GGT基

20、因甲基化类型、GGT基因表达与GGT活性的关系，以及正常肝GGT的甲基化状态等尚有待深入研究。国家教委留学回国人员课题(No.教外司留95)作者单位：224001江苏省盐城市第一人民医院(汤琪云)；南通医学院附属医院(姚登福、刘艳华、孟宪镛、吴信华、吴玮、陆建新)；盐城市第二人民医院(杨树成)参考文献1. 姚登福，孟宪镛.肝癌特异性GGT诊断肝癌的研究进展.国外医学内科学分册，1997，24：59-62.2. 姚登福，黄介飞，陈澍周，等.肝癌特异性GGT的发生及其定量分析的临床价值.胃肠病学和肝脏病学杂志，1997，6：78-81.3. Choi EK, Uyeno S, Nishida N,

21、 et al. Alterations of c-fos gene methylation in the processes of aging and tumorigenesis in human liver. Mutation Res, 1996, 354:123-128.4. Peng SY, Lai PL, Chu JS, et al. Expression and hypomethylation of -fetoprotein gene in unicentric and multicentric human hepatocellular carcinomas. Hepatology,

22、 1993, 17:35-41.5. Okamoto T, Darbouy M, Broullet A, et al. Expression of the rat -glutamyl transferase gene from a specific promoter in the small intestine and in hepatoma cells. Biochemistry, 1994, 33:11536-11543.6. 汤其云，姚登福，刘艳华，等.鼠肝癌变过程中总RNA及不同分子形式GGT的表达与改变.南通医学院学报，1998，18：139-141.7. Countay L, Heisterkamp N, Siest G, et al. E