二氮嗪停搏液对缺血再灌注心肌线粒体保护作用

1、二氮嗪停搏液对缺血再灌注心肌线粒体保护作用 作者：李寒,张载高,范士志,陈建明,蒋耀光 【摘要】 目的 观察线粒体三磷酸腺苷(ATP)敏感钾离子通道开放剂二氮嗪加入停搏液内对缺血再灌注大鼠心肌线粒体保护作用。方法 50只大鼠随机分为5组，每组10只，取离体心脏，A 组取正常心肌，其余四组置于Langendorff模型。B组停灌30 min, 复灌60 min；其余各组分别灌注不同的停搏液：C组灌注停搏液；D组灌注含二氮嗪的停搏液；E组灌注含二氮嗪停搏液之前10 min给予格列苯脲。各组复灌60 min取标本，电镜下观察线粒体结构改变；提取线粒体，激光共聚焦显微镜扫描检测线粒体膜电位变化；测定线

2、粒体呼吸功能；高效液相法测定心肌ATP含量及能荷(EC)变化。结果 缺血再灌注心肌线粒体结构损伤和功能降低(P0.05)；而二氮嗪处理组相应指标显著改善(P0.01)。结论 含二氮嗪停搏液能够改善缺血再灌注心肌线粒体结构和功能。 【关键词】 心肌缺血再灌注损伤;线粒体;线粒体呼吸控制率;二氮嗪 Protective Effect of Cardioplegia with Diazoxide to Myocardial Mitochondrion during Ischemic and Reperfusion in Isolated Working Rat Heart Abstract: OBJ

3、ECTIVE To evaluate the effects of mitochondrial ATP- sensitive potassium channel opener diazoxide on heart mitochondrion during ischemic and reperfusion in rats. METHODS Fifty rats were divided into 5 groups randomly. Langendorff model was established. Control group (B) underwent 30 minute ischemia

4、and 60minute reperfusion. Group C and D were treated with St.Thomas cardioplegia and diazoxide+St.Thomas cardioplegia before ischemia respectively. And group E was treated with glibenclamide at 10min before Diazoxide+st.Thomas cardioplegia. At the end, mitochondrial changes were detected under the t

5、ransmission electron microscope(TEM),the respiration function of mitochondrion was determined,ATP,ADP,AMP content of myocardium were determined and energy charge (EC) were calculated. RESULTS Ischemic and reperfusion injury induced the structure damaged and function decrease of myocardial mitochondr

6、ial. While in group D(P0.01), the heart was protected effectively by treating with diazoxide. CONCLUSION These results suggest that diazoxide has a protective effect on myocardial mitochondrion during ischemic and reperfusion in rats. Key words： Myocardial ischemic and reperfusion injury; Mitochondr

7、ial; Respiration function; Diazoxide 缺血再灌注损伤是心脏直视手术后出现心功能不全等并发症的重要原因之一。近年来研究证明, 心肌线粒体三磷酸腺苷敏感性钾通道(MitoKATP)是心肌缺血再灌注损伤的重要治疗靶点。二氮嗪（diazoxide，DZ）是MitoKATP开放剂, 具有对缺血再灌注心肌的保护作用。本研究采用体外大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察了DZ对线粒体结构、膜电位、线粒体呼吸功能、ATP等的影响，探讨其心肌保护作用及机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物 健康成年大鼠50只，雌雄不限，由大坪医院实验动物中心提供。 1.2 药品与试剂 DZ、格列

8、苯脲购自Sigma公司。 1.3 分组及模型制备 50只大鼠随机分为5组，每组10只，A 组取正常心肌，其余四组置于Langendorff模型。B组停灌30 min, 复灌60 min；其余各组分别灌注不同的停搏液：C组灌注停搏液；D组灌注含二氮嗪的停搏液；E组灌注含二氮嗪停搏液之前10 min给予格列苯脲，各组复灌60 min。 1.4 标本收集与检测 标本分为两部分：部分心肌电镜下观察线粒体结构改变；部分心肌提取线粒体，激光共聚焦显微镜扫描检测线粒体膜电位变化。测定反应呼吸功能的呼吸控制率（RCR）；高效液相法测定心肌ATP含量及能荷（EC）变化。 1.5 统计学处理 应用SPSS 10.

9、0统计软件处理。所有数据均采用均数标准差(s)表示。P0.05为有显著性差异。 2 结果 2.1 各组心肌线粒体结构损伤 电镜下可见A组心肌线粒体数量多，膜完整，嵴及其上附着之基粒结构清晰，无断裂。B组可见线粒体数目明显减少，膜结构不清晰，肿胀，部分线粒体出现空泡，嵴减少，结构不清，断裂，部分消失。经停搏液保护C组线粒体损伤较B组明显减轻，线粒体数目基本正常，稍显肿胀，未见明显空泡，膜结构欠清晰，嵴减少，结构不清，无断裂。而经DZ处理后D组线粒体结构损伤进一步减轻，基本接近正常，线粒体数量较多，部分肿胀，膜完整，未见空泡，嵴及其上附着之基粒结构比较清晰，无断裂。E组线粒体结构与C组接近。见图1

10、、2、3。 图1 B组心肌线粒体结构（电镜）（略） 图2 C组心肌线粒体结构（电镜）（略） 图3 D组心肌线粒体结构（电镜）（略） 2.2 各组线粒体膜电位变化 B组线粒体膜电位较A组显著降低（P0.01 ），C组线粒体膜电位与B组相比有明显升高，差异有统计学意义（P0.01）。D组心肌线粒体膜电位较C组也有明显升高（P0.05），但仍明显低于D组（P0.01）。具体见表1。 表1 各组心肌线粒体膜电位变化（略） 注：各组比A组比较，*P0.05；*P0.01；各组间与D组比较，P0.05,P0.01 2.3 各组心肌线粒体呼吸功能的变化 与正常对照组比较，B组心肌ST3及RCR明显降低，(P

11、0.01)，但C组显著高于B组(P0.01 或P0.05)，ST4接近正常。D组明显优于C组及E组(P0.01)。具体见表2。 2.4 各组心肌ATP及EC含量变化 B组ATP含量较A组显著降低（P0.01 ），C组ATP含量与B组相比有明显升高，差异有统计学意义（P0.01）。D组心肌ATP含量较C组也有明显升高（P0.05），但仍明显低于正常，相反E组虽高于C组，但仍明显低于D组（P0.05）。EC变化趋势同ATP基本一致。具体见表3。 表2 各组心肌线粒体呼吸功能的变化（略） 注：各组与A组比较*P0.05, *P0.01；各组与D组比较P0.05,P0.01 表3 各组线粒体呼吸功能的

12、变化（略） 注：各组与A组比较*P0.05, *P0.01；各组与D组比较P0.05, P0.013 讨论 线粒体结构和功能的损伤在心肌缺血再灌注损伤机制中起重要的作用。心脏直视手术中心肌缺血及再灌注可导致线粒体损伤、功能紊乱，跨膜电位崩溃使质子梯度不能形成，ATP产生受阻，需要供能的生化过程陷于停顿；糖有氧氧化受抑制，脂肪酸氧化加强，心肌能量缺乏，从而通过不同途径引起细胞结构和功能失调，影响心脏功能的恢复1。因此可以推断，围手术期加强心肌线粒体的保护，可以减轻心肌缺血再灌注损伤，促进术后心脏功能的恢复。 线粒体内膜上存在ATP敏感的选择性K+通道，对生物膜的稳定性、线粒体及心肌细胞的功能起着

13、非常重要的作用2-3。开放MitoKATP可调节线粒体膜电位、膜通透性、线粒体内钙含量还能改变线粒体基质含量及组成成分。国外研究发现给予MitoKATP通道开放剂DZ可减轻心肌缺血再灌注损伤4-6，但对其机制仍有争议。本实验通过制备离体缺血再灌注和工作心脏模型，观察缺血再灌注心肌线粒体结构和功能变化以及DZ对其保护作用及机制。 线粒体膜功能的破坏目前被认为是许多外来刺激诱导细胞凋亡的共同通路，线粒体膜电位下降是心肌细胞凋亡早期的重要特征。线粒体跨膜电位降低反映跨膜离子梯度的改变，伴随膜通透性发生改变，使促凋亡因子释放，导致细胞凋亡。本实验中我们观察到，在心肌缺血和再灌注过程中，线粒体膜电位降低

14、，膜通透性增大，与正常相比具有显著性差异（P0.01）。应用MitoKATP通道开放剂DZ，与高钾停搏液相比，使线粒体膜电位进一步恢复（P0.01），线粒体损伤也进一步减轻。有研究发现3,7，MitoKATP开放剂可调节正常细胞线粒体膜电位、膜通透性，在心肌缺血再灌注时减少细胞色素C释放，与本实验结果一致。 本实验中观察到，B组同正常对照组相比，再灌注后心肌线粒体RCR明显降低(P0.01)，ATP含量和EC显著下降(P0.01)； C组较B组各项指标有所改善(P0.01)；而D组相比C组也有显著改善 (P0.01)。表明附加DZ的心脏停搏液能显著提高线粒体呼吸功能，增加心脏的能量储备，保护线

15、粒体功能，减轻再灌注损伤。其可能机制是：缺血期间DZ开放mitKATP，可能起到缺血预适应的作用，保护线粒体，减少ATP的水解，再灌注时减少线粒体钙离子超载，促进线粒体呼吸功能的恢复，进而促进能量物质的合成8-10。 【参考文献】 1 Sadek HA, Nulton-Persson AC,Szweda PA,et al. Cardiac ischemia/reperfusion, aging, and redox-dependent alterations in mitochondrial functionJ. Arch Biochem Biophys,2003,420(2):201-208

16、.2 Gross GJ,Fryer RM. Sarcolemmal versus mitochondrial ATP-sensitive K+ channels and myocardial preconditioningJ. Circ Res,1999,84(9):973-979.3 Lacza Z，Snipes JA，Miller AW,et al. Heart mitochondria contain functional ATP-dependent K+ channelsJ. J Mol Cell Cardiol,2003,35(11)：1339-1347.4 Holmuhamedov

17、 EL, Jovanovic S, Dzeja PP,et al. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channels modulate cardiac mitochondrial functionJ. Am J Physiol,1998;275(5 Pt 2):H1567-576.5 Korge P ,Honda HM,Weiss JN. Regulation of the mitochondrial permeability transition by matrix Ca2+ and voltage during anoxia/reoxygenationJ. A

18、m J Physiol Cell Physiol,2001,280(3):C517-526.6 ORourke B. Myocardial KATP channels in preconditioningJ. Circ Res, 2000;87:845-855.7 Dos Santos P, Laclau MN, Boudina S,et al. Alterations of the bioenergetics systems of the cell in acute and chronic myocardial ischemia J. Mol Cell Biochem, 2004, 256-257(1-2): 157-166.8 Maskal SL,Cohen NM,Hsia PW,et al. Hyperpolarized cardiac arrest with a potassium-channel opener, aprikalimJ. J Thorac Cardiovasc Surg,1995,110(4 Pt 1):1083-1095