颞下颌关节盘前移位动物实验的细胞外基质研究

1、    颞下颌关节盘前移位动物实验的细胞外基质研究        摘要：目的：探讨兔颞下颌关节盘前移位后，关节结构中某些细胞外基质成份的改变。方法：在建立颞下颌关节盘前移位动物模型的基础上，通过偏振光显微镜，改良Masson染色以及阿辛蓝染色，观察30只兔关节盘、髁状突的胶原纤维以及糖胺多糖的变化。结果：细胞外基质研究表明，关节盘前移位术后，关节盘中间带胶原纤维明显断裂，双板区出现含胶原纤维的假性关节盘。早期髁状突糖胺多糖丧失，术后4周开始糖胺多糖合成增加。在关节盘穿孔的标本

2、糖胺多糖持续减少。结论：关节盘前移位可导致胶原纤维破坏，糖胺多糖合成增加。发生严重关节软骨破坏的病例中，糖胺多糖合成减少。关键词：颞下颌关节；盘前移位；动物模型；细胞外基质中分类号：R782.6文献标识码：A文章编号：1005-4979(1999)03-218-04 EXTRACELLULAR MATRIX CHANGES OF THE DISC DISPLACEMENT OF TEMPOROMANDIBULAR JOINT IN ANIMAL MODELLONG Xing, LI Jin-rong， XIONG Shi-chunSchool of Stomatology, Hubei Med

3、ical University, Wuhan, China. 430079Abstract: Object： To discuss extracellular matrix changes in the temporomandibular joint of surgical induction of anterior disc displacement (ADD) in the rabbit. Methods： After surgical induction of anterior disc displacement in the rabbit, the collagenous fiber

4、bundles and glycosaminoglycans (GAGs) in the disc and condyle of thirty rabbits were determined by using circular polarizing light, modified Masson stain and Alcian blue stain.Results： Extracellular matrix changes showed that there were fragmentation of the collagen fibers in the intermediate zone o

5、f the experimental disc and the disc-like change in the posterior attachment, the loss of glycosaminoglycans (GAGs) at early stage after inducing ADD and the increased synthesis of GAGs in 4 weeks ADD group, but there was decreased synthesis of GAGs in perforation group.Conclusion: There are derange

6、ment of collagen fibers and increased synthesis of GAGs in surgical induction of anterior disc displacement in the rabbit. There are decreased synthesis of GAGs in the sample of severe arthritic changes.Key words: Temporomandibular joint; Anterior disc displacement; Animal model; Extracellular matri

7、x细胞外基质(extracellular matrix ECM)包括不同类型的胶原蛋白，各种蛋白多糖或糖胺多糖，弹性蛋白以及一些具有粘连作用的糖蛋白。由于细胞外基质成分的存在，细胞与细胞才能结合构成组织，细胞外基质的组成与表达，在生理、生化中起着重要的作用。当细胞外基质的组成与表达发生改变时，则可出现病理性改变。本文主要探讨颞下颌关节盘前移位后，关节结构中某些细胞外基质成份的改变。1材料与方法1.1实验动物30只日本大耳白兔146月龄，23kg，5只动物为正常对照组，其余25只随机将一侧关节作为手术组，另一侧关节作为手术对照组。其中1周5只，2周组5只，4周组5只，8周组5只，12周组5只。1

8、.2建立动物模型手术组与手术对照组动物在手术前称体重，耳静脉麻醉。全麻后，消毒，铺巾。切开手术组动物一侧关节区皮肤、皮下组织达骨膜下，用骨膜剥离器翻瓣，显露颞骨颧突根部以及关节结节前方的关节囊，用丝线垂直穿过关节盘前带的延伸部并拉丝线向前，此时关节盘前移。将缝线穿过眶下缘中点前方的颧弓上，并固定1。手术对照组的手术步骤与手术组相同，不缝合关节盘前带的沿伸部，也不将关节盘拉向前方。1.3动物标本处理正常对照组动物，手术组与手术对照组动物分别于术后1周、2周、4周、8周、12周，经耳静脉注射过量戊巴比妥钠致死。将兔左、右关节区锯成2cm3的组织块，冲洗，用甲酸枸橼酸脱钙液脱钙2周。脱钙完毕后，用锐

9、利刀片从关节组织块的正中矢状面，将关节组织切成两半。乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。沿关节标本正中矢状面连续切片5张，切片厚度6m，分别进行偏振光显微镜观察；改良Masson染色以及阿辛蓝(Alcian Blue)染色。改良Masson染色方法：石蜡切片脱蜡，蒸馏水洗，入地衣红染色液15min，水洗后再入苏木素染液2min，盐酸分化，水洗显蓝后，入丽春红液3min，水洗。入亮绿染液2min，脱水，透明，封固。染色结果显示：胶原纤维呈绿色，弹力纤维呈棕色，纤维素呈红色。阿辛蓝染色方法： 5%阿辛蓝醋酸缓冲液(pH5.8)100ml加入0.4mol/L MgCl2。切片脱蜡至水加入上液后过夜，

10、水洗，脱水，透明，封片。结果显示硫酸软骨素和硫酸角质素呈蓝色。 5%阿辛蓝醋酸缓冲液(pH 5.8)100ml加入0.9mol/L MgCl2。切片染色方法同上。结果显示：硫酸角质素呈蓝色。2结果2.1偏振光显微镜观察正常对照组：可见关节盘中间带粗大的胶原纤维束呈连续的前后走向，在前后带见胶原纤维束呈内外走向的横断面。髁状突与关节结节表面有一层连续狭窄的细纤维折射带(1)。手术对照组与正常对照组相同。1兔正常颞下颌关节偏振光示关节盘中间带前后走向，连续的纤维折射。(偏振光10×)手术组：25侧中有6侧出现关节盘穿孔，其余关节盘前移位。关节盘前移位的标本术后1，2，4周，中间带断裂呈鳞

11、片状，后带出现前后走向的纤维折射，关节结节表面纤维连续，髁状突部分纤维裂(2)。术后8周，中间带胶原纤维断裂，髁状突及关节结节纤维变粗。术后12周，关节盘胶原纤维断裂变形，髁状突及关节结节部分区域胶原纤维增厚(3)。关节盘穿孔的标本，髁状突与关节结节表面纤维消失。2颞下颌关节盘前移位术后1周，关节盘中间带呈点状纤维折射。(偏振光10×)3颞下颌关节盘前移位术后12周，关节盘胶原纤维断裂变形。(偏振光10×)2.2Masson染色正常对照组与手术对照组见髁状突表面纤维层，未分化间充质细胞层，关节盘中间带，关节结节纤维层以及滑膜染成红色。关节盘前后带，关节结节软骨样骨以及髁状突

12、软骨细胞层染成绿色(4)。4兔正常髁状突功能区。(Masson染色50×)术后1周组，髁状突与关节结节绿染明显减少，部分区域消失，滑膜增厚，双板区弹力纤维与胶原纤维增多组织致密。术后2周组，关节结节与滑膜改变同术后1周组，关节盘穿孔标本髁状突部分区域绿染增加。术后4周组，髁状突及关节结节绿染明显增多，双板区似盘样变(5)。术后8周组，髁状突功能区绿染减少，髁状突前缘，关节结节后斜面绿染增多，滑膜增厚，双板区纤维松解断裂(6)。术后12周组，髁状突表面红染减少，部分区域消失，关节结节顶绿染消失，双板区致密组织明显增厚。5颞下颌关节盘前移位术后4周，双板区关节盘样变，绿染明显增多。(Ma

13、sson染色25×)6颞下颌关节盘前移位术后8周，关节盘双板区棕色的弹力纤维与绿色的胶原纤维出现疏松、断裂(Masson 25×)2.3阿辛蓝染色：正常对照组与手术对照组0.4mol/L MgCl2浓度，髁状突软骨细胞层着色明显，功能区与非功能区染色一致(7)。0.9mol/L MgCl2浓度髁状突、关节结节、关节盘着色均较淡。7兔正常颞下颌关节阿辛蓝0.4M MgCl2浓度染色，见髁状突功能区，非功能区有均匀一致的蓝染。(Alcain Blue 10×)0.4mol/L MgCl2浓度术后1周组，髁状突软骨细胞层着色变浅，关节结节着色加深。术后2周组，关节盘前移

14、位标本髁状突功能区部分着色加深，部分区域无染色(8)，功能区比非功能区染色淡，关节盘后带以及与后带相对的关节结节着色加深。关节盘穿孔标本髁状突功能区与关节结节染色浅。术后4周组，关节盘前移位标本髁状突功能区与关节盘染色加深(9)。关节盘穿孔与术后2周组相同。术后8周组，关节盘前移位标本髁状突功能区染色比非功能区浅，关节盘穿孔标本髁状突功能区与关节结节染色极淡，术后12周组与术后8周相同。0.9mol/L MgCl2浓度关节标本手术组均较对照组着色浅，术后2、4、8、12周关节盘前移位标本，在关节盘、关节结节，髁状突表面出现着色。8颞下颌关节盘前移术后2周，髁状突部分区域蓝色丧失。(Alcain

15、 Blue 25×)9颞下颌关节盘前移位4周，关节结节后斜面、关节盘后带着色加深。(Alcain Blue 10×)3讨论颞下颌关节的关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质组成。细胞外基质中的胶原纤维，通过交联、编织形成一个胶原纤维三维立体空间网、蛋白多糖大分子聚合物缠绕在胶原纤维网上，占据基质间隙。蛋白多糖大分子聚合物是由核心蛋白连接无数糖氨多糖形成链，再由透明质酸将许多核心蛋白连接则形成蛋白多糖。由于蛋白多糖是具有高度亲水性的大分子物质，在软骨中受到胶原纤维网的限制而形成静水区，使胶原纤维网处于持续的张力2，这种张力与外部的压力保持一定的平衡。正常颞下颌关节髁状突与关节结节

16、软骨中主要有型与型胶原，型胶原分布在增殖带与纤维带，型胶原存在于软骨基质中，关节盘软骨细胞样细胞周围有型胶原。Mills3在对正常兔颞下颌关节盘的偏振光显微镜观察中发现，兔的关节盘与人以及猴关节盘的结构相似，即中间带是前后走向粗大的胶原纤维并与内外走向的前、后带胶原纤维束相交叉。本文正常对照组与手术对照组偏振光显微镜的观察结果与Mills研究结果一致。同时在髁状突与关节结节的表面也发现一层薄的胶原纤维折射带。本文关节盘前移位的标本中，致密呈前后走向排列的中间带胶原纤维出现松解、断裂，成点状、鳞片状，关节盘后带以及双板区出现粗大前后走向的胶原纤维。在正常颞下颌关节双板区型胶原含量很少，而在颞下颌

17、关节功能紊乱的病例中，双板区发现有大量的型胶原4。在灵长类动物的颞下颌关节双板区中没有发现型胶原，只在关节盘中发现有型和型胶原5。本文在关节盘后带以及双板区出现粗大胶原纤维，说明关节盘与双板区的胶原纤维类型发生了变化。Salo等6用果莫里氏网状细胞染色(Gomori's reticularstain)的方法在颞下颌关节病的髁状突中发现，型胶原存在于改建的骨组织以及新生的软骨骨样组织。在颞下颌关节结构紊乱的中期阶段，型胶原主要存在于修复的纤维组织中，也出现在髁状突软骨修复的部位。本文中关节盘前移位与穿孔的早期，髁状突与关节结节表层正常的一层薄纤维折射带出现断裂甚至部分消失。到后期(8、1

18、2周)，髁状突与关节结节表面出现增厚的折射带，可能与颗状突关节软骨的修复有关。本文Masson染色中发现，兔关节盘前移位后髁状突关节结节在早期绿染减少，说明胶原纤维以及软骨细胞相应减少。从术后4周开始髁状突绿染增加，可能与软骨细胞，胶原纤维，蛋白多糖的合成增加有关。在双板区由正常绿色和棕色交杂的疏松结缔组织，变成增厚致密的绿染关节盘样组织，部分标本可以见到棕色的弹力纤维与绿色的胶原纤维发生断裂。这种改变可能是颞下颌关节超负荷时由未分化间充质细胞产生的型胶原代替了型胶原和弹力纤维。关节软骨中的糖胺多糖主要包括硫酸软骨素和硫酸角质素。用阿辛蓝染色的方法，观察人类关节盘与髁状突糖胺多糖的分布发现，硫

19、酸软骨素与硫酸角质素存在于下颌髁状突的软骨细胞层和关节盘的负重区。硫酸角质素位于成熟的成软骨细胞周围的细胞外基质中，硫酸软骨素位于关节软骨的深层，硫酸角质素与硫酸软骨素在关节盘软骨细胞样细胞周围5。有报道表明，关节软骨与关节盘纤维软骨中硫酸角质素比硫酸软骨素含量低7。所以在阿辛蓝染色中，0.9mol/L MgCl2浓度的着色很淡。Ali等7发现关节盘前移位术后2周的动物标本，关节软骨、糖胺多糖开始明显丧失。本文动物实验术后1、2周髁状突软骨细胞层阿辛蓝染色明显变淡，说明糖胺多糖丧失。这种糖胺多糖的丧失是由于合成降低而降解增加。型胶原的破坏和分解是引起糖胺多糖丧失的原因，因为糖胺多糖在髁状突软骨

20、细胞层中，缠绕在型胶原上。另外糖胺多糖的丧失还与金属蛋白酶有关。软骨细胞和滑膜成纤维细胞受细胞因子刺激而分泌金属蛋白酶，金属蛋白酶使糖胺多糖降解的部位发生在透明质酸结合区以及核心蛋白的硫酸软骨素区。在关节负荷增加的情况下，糖胺多糖的合成可伴随修复反应而增加，Ali等7动物实验发现关节盘前移位术后6周关节软骨糖胺多糖合成增加。双板区糖胺多糖明显增加使其呈假性关节盘。这种合成的增加是由于关节组织进行重建，但并不是所有软骨细胞都有能力再生，而且新合成的糖胺多糖比正结构常短，相对来说功能就差一些。本文关节盘前移位的标本，在术后4周糖胺多糖增加，但关节盘穿孔的标本糖胺多糖的丧失明显，而且在术后12周仍未

21、见糖胺多糖的增加。说明在发生严重关节软骨破坏的病例中，糖胺多糖合成减少。作者简介：龙星(1957-)，男，博士，副教授作者单位：湖北医科大学口腔医学院(430070)参考文献：1龙星，李金荣.颞下颌关节盘前移位的动物模型.中华实验外科杂志，1998，15：184.2DeBont LGM, Stegenga B. Pathology of temporomandibular joint internal derangement and osteoarthrosis. Int J Oral Maxillofac Sur, 1993,22:71.3Mills DK, Daniel JC, Scapino R. Histological features and in vitro proteoglycan synthesis in the rabbit craniomandibular join