钛合金抗菌界面的构建本科毕业论文

1、. . . . 大学本科学生毕业设计（论文） 钛合金抗菌界面的构建学 生：何浩学 号：20116925指导教师：鹏 专 业：生物工程大学生物医学工程联合学院二O一五年六月Graduation Design(Thesis) of Chongqing Universityconstruction ofTitanium alloyantibacterial interfaceUndergraduate: HeHaoSupervisor: Prof.LiuPengMajor: BioengineeringBioengineering College ofChongqing UniversityJune

2、 201524 / 34摘 要钛与其合金材料由于其良好的生物相容性和力学特性广泛用作骨科植入物。然而，钛基植入材料的术后感染已经成为其临床手术失败的一个重要原因。严重的细菌感染染甚至导致重复手术。因此，开发具有长期抗菌功能的钛基植入材料对于其临床成功植入具有重要意义。本文旨在利用层层自组装技术在钛材表面构建含锌离子的涂层，以期改善钛基植入材料的抗菌性能。本文具体包含如下研究容： 1）在钛合金表面通过层层自组装技术对钛材进行表面改性，以阳离子的聚乙烯亚胺作为第一层，然后按明胶/壳聚糖/Zn离子溶液的顺序铺膜，构建含锌离子的抗菌涂层。抗菌涂层的表面形貌和元素组成通过扫描电镜和EDS能谱进行了表征。

3、测定结果表明：本次实验通过层层自组装技术在钛合金表面成功的构建了含锌离子的抗菌涂层。2）在本论文中，金黄色葡萄球菌被用于未处理的钛材和层层自组装技术处理后的钛材的抗菌性能评价。通过抑菌圈实验，抑菌率和耐受性实验考察了材料的抗菌性。实验结果显示：层层自组装技术处理后的钛材表面有效降低了细菌的粘附和生长。本论文研究成果初步表明：层层自组装技术在钛材表面构建含锌离子的抗菌涂层，改善了钛基植入材料的抗菌性能，研究成果为钛与其合金在骨组织修复方面的应用提供了坚实的基础。关键词：钛基材料，层层自组装技术，锌离子，抗菌涂层，金黄色葡萄球菌ABSTRACTTitanium and its alloy mate

4、rial due to its good biocompatibility and mechanical properties are widely used as orthopaedic implants. However, postoperative infection of titanium implant material has become the one of the important reasons for the clinical surgery failure. Serious bacterial infection of dye even lead to repeat

5、the operation. Therefore, development with long-term antibacterial function of titanium implant material implant is of great significance to the clinical success. The purpose of this paper is to use layers of self-assembly technology in titanium coating on the surface building zinc ions in order to

6、improve the antibacterial properties of titanium implant material. The present work contains the following aspects:1. Through layer upon layer on titanium alloy surface self-assembly technology for surface modification of titanium, with cationic polyethyleneimine as the first layer, and then press g

7、elatin/chitosan/zinc ions is the order of the membrane, build antibacterial coatingcontaining zinc ions.Antimicrobial coating surface morphology and elemental composition by scanning electron microscopy (sem) and EDS spectrum characterization. Determination results show that this experiment through

8、layer upon layer self-assembly technology in titanium alloy surface and the success of the building containing zinc ions antibacterial coating. 2. In this thesis, staphylococcus aureus was used for untreated titanium and layers of self-assembly technology after processing of titanium antibacterial p

9、erformance evaluation. Through the bacteriostatic circle experiment, antibacterial rate and tolerance experiment investigates the antimicrobial properties of the material. Experimental results show that after processing of titanium surface layers of self-assembly technology effectively reduces the a

10、dhesion and growth of bacteria.This paper preliminary research results show that the layers of self-assembly technique in titanium surface antibacterial coating containing zinc ions, improved the antibacterial properties of titanium implant material, the research for the application of titanium and

11、its alloys in bone tissue repair provides a solid foundation.Key words： titaniumbased materials, layer-by-layer self-assembly, Zinc Ion,Antimicrobial coating, Staphylococcus aureus 目录摘 要IABSTRACTII1.1生物医用钛材的发展现状11.2课题引入22 钛合金抗菌涂层的构建42.1简介42.2材料与方法52.2.1材料与设备52.2.2层层自组装构建涂层52.2.3表面特征62.2.4涂层耐腐蚀性

12、能测试62.3结果与讨论62.3.1涂层分析72.3.2结论83 改性后钛材的抗菌能力评估83.1简介103.2材料与方法113.1.1材料与设备113.1.2细菌的培养123.1.3细菌电镜样品的制备133.2抗菌性能测试133.2.1抑菌圈实验133.2.2抑菌率实验143.2.3材料耐受性测试143.3 结果与讨论153.3.1电镜分析153.3.2抑菌圈实验分析153.4 结论174 总结184.1 全文综述184.2致191 绪论1.1生物医用钛材的发展现状中国是一个拥有13 亿人口的大国，也是一个骨组织修复材料的需求大国。仅以人工关节为例，据统计我国大约有1500万人患有关节疾病，

13、每年人工关节的需求量约为3040万支，按平均20000元/装置计算，总产值为6080亿1。然而我国临床使用的骨修复植入体/装置大部分依赖于国外进口，因此开发具有自主知识产权的新型骨修复植入体（含人工关节）产品，具有很大的市场潜力，将产生良好的经济效益，同时将会造福于人类健康，带来巨大的社会效益。近年来，随着医疗水平的不断提高，越来越多的病患接受了固定和人工关节置换手术，各类外植入材料的使用率日益上升。生物医用材料是用于取代或修复人体原活组织的材料，它可以是天然的或者人造的。近年来，随着人们生活水平的提高，对于生活质量的要求越来越高；越来越多受意外创伤、运动创伤、疑难病症以与需要替换组织的患者接

14、受了固定和人工关节置换手术，各种生物医用材料的使用率增长迅速。因此生物材料领域在当今社会是备受关注的，它的发展对于人们生活质量的提高具有显著的影响2。而随着材料学和生物学的研究深入，让我们对生物医用材料有了新的认识。目前,生物医用材料分为金属、高分子、无机非金属或瓷、复合材料等。在生物医用金属材料中，主要有不锈钢、钛与钛合金、钴基合金等几大类型。其中钛与钛合金与传统不锈钢材料相比，它具有良好的耐腐蚀性能和组织相容性。 伴随着物理、生物、化学等学科的快速发展，尤其在临床生物医用材料不断研发和使用的当下，金属材料已成为医用外植物不可或缺的基本材料。良好的耐腐蚀性能以与优异的综合理化性能，使得多种金

15、属材料运用于临床医学，在众多材料中，钛合金因其优异的理化特性而成为研究的热点。 人类生物医学发展史上最早是运用金属材料来实现机体的创伤修复和矫形治疗。但由于医用不锈钢、钴铬合金在二战初期已开始盛行，钛材料运用于生物医学领域的发展比较滞后。最早将钛作为外植体的案例是将纯钛作为口腔外植体，之后纯钛作为外植体材料得到了广泛发展3。随后钛合金也开始在临床上被运用作股骨和胫骨替换材料3。进入21世纪后，由于钛合金材料良好的综合理化性能用钛材做成的医疗植入物，被广泛的用于牙科，骨科和心血管领域。伴随着自然科学与生命科学的快速发展，材料科学也得到了蓬勃的发展，尤其是在临床生物医用材料的研发和使用方面。其中对

16、金属材料作为医用外植体的研究已经成为医学治疗中不可或缺的重要分支4。 通常在钛合金材料植入体后, 钛合金与人体环境中的无机盐、蛋白质、有机酸和碱金属等长时间接触，机体某些物质可能会诱导金属腐蚀, 使材料中所含的金属离子溶解出来, 游离的金属离子进入人体组织细胞，影响其中的正常生化反应, 同时, 钛合金腐蚀所产生的物质和电流可能会激活组织, 使人体的物质代发生改变67。另外,虽然正常情况下人体体液呈中性, 但在受伤或组织感染之后, 病变组织周围的pH会低至5 左右, 在钛合金材料植入时，植入材料部位处于酸性环境之中, 钛合金材料会加快腐蚀8。所以, 当钛合金材料用于心血管系统和血液接触时,应该慎

17、重考虑材料与血液中各成分的相互作用, 以此来提高材料与血液的相容性。这就要求对钛合金材料进行功能需求的表面工程改性技术。随着表面工程技术不断完善和发展，已经产生了各种不同的表面改性技术,如：电化学处理、化学蚀刻、热处理、离子注入、激光、电子束辐射与各种涂层。这些技术旨在外植物材料表面创造一个均一的,具有一定厚度的涂层,其不仅能作为一个屏障,而且还可以提高材料的生物学性能9。对钛合金材料进行表面修饰后，涂层与基底结合的牢固性是材料表面改性成功与否的重要指标。通过传统表面工程技术制备的涂层，往往较厚，与基材的结合力差，在钛合金形变过程中，容易脱落，难以达到预期效果。在金属表面改性过程中，往往要包括

18、使用各种160和600 之间的各种温度进行(热处理、激光和电子束熔炼、离子注入)处理，通常热处理合金会影响其形状记忆性能和超弹性9。由于上述处理会使材料表面组成和结构发生变化，导致钛合金植入物中金属离子释放量亦随之显著变化。因此，在对钛合金进行表面进行处理时，应该尽量减少影响，以减少材料的毒性。1.2课题引入阳极氧化技术是一种新兴的表面改性技术，实现对材料的表面改性相对简单。阳极氧化技术对设备的要求仅仅为简单的电源与冷却系统，不需要真空或者高温、低温控制设备，其处理步骤简单、效率高、处理能力强，此技术作为一种非线性的表面处理技术，可以加工复杂形状的工件10。阳极氧化技术与其它钛合金表面处理方法

19、相比优点明显：1.加工时间短，不会改变基材本身的相结构，保持了基材本身的优异性能；2.可以根据不同的实际需要，选择不同组成的电解液，改变实际工艺参数，调节涂层的表面形状和微观结构。研究发现，化学或电化学方法处理的表面改性技术能提供各种厚度<1 m的涂层，并且涂层在形变过程不易脱落。然而阳极氧化技术作为一种表面改性技术对于材料本身的细胞响应性和骨整合性能的提高，作用十分有限。 上世纪90年代，Decher11等人提出了基于带正负电荷的聚电解质逐层组装技术制备涂层。层层自组装技术作为一种先进的表面工程技术为生物材料的表面修饰提供了一条新途径。是一种多功能，高效率，容易实现，可处理多种表面的功

20、能化的表面处理技术。层层组装技术操作简单，不受基材尺寸、形状与性质的限制，对于基质表面的化学结构和功能基团没有特殊要求，适合于具有复杂表面形貌的基材；在涂层构建中无需提供外加能量，可以使用各种活性生物大分子（核酸、蛋白质、多肽等）、天然高分子和纳米粒子制作为组装的基本单元，能够对涂层的形貌、厚度、化学性质和模量等进行自由调节；在操作过程中不需要特殊的装置，只要依照特定顺序将基材在两种聚电解质溶液替浸泡后，水洗，干燥，即可完成多种功能单元的组装，实现多种物质的层层自组装；层层自组装涂层制备技术简单方便，有望实现工业化生产；与传统的涂层制备技术相比，层层自组装技术所具有的上述优点使其更加适合于材料

21、表面生物活性涂层的构建12。 本试验欲在钛合金材料表面通过阳极氧化与层层自组装技术对钛合金材料进行表面改性，使钛合金材料具备优异的抗菌性能。那么抗菌离子的选取成为了本次试验的关键。 目前金属离子抗菌的应用前景最广泛的是银系，铜系，锌系，其中银离子的综合杀菌能力最优，但由于银离子的价格高昂，对比具有较强抗菌性能的铜离子、锌离子就失去了优势。研究表明同种抗菌剂处理的不同菌体，抗菌效果是不同的，因为不同细菌细胞壁的厚度和化学成分有差异13。细胞的基本结构中细胞壁在最外层，如果细胞壁受到损伤，细胞便难以生长，甚至会死亡。本试验综合试验要求与自身试验条件选取了锌离子作为抗菌剂，其原因如下：锌元素是机体生

22、命活动必需微量元素之一。锌元素对全身骨骼的生长和发育起到重要作用。同时锌元素在维持骨骼生理结构功能方面也扮演着重要的角色。其主要生理功能: 1.锌元素是细胞的重要组成，其对维持细胞结构与生理功能有着重要作用，锌元素能催化体活性因子参与机体的化学反应。 2.锌参与了多种酶的合成，而酶在细胞代与信息传递中起到了关键作用人体的许多生命物质中都含有锌，如DNA聚合酶,、RNA聚合酶、淡肤酶、胸腺嗯陡普激酶、碱性磷酸酶、碳酸醉酶等200多种酶的组成或激活因子都含有锌元素14。锌元素也可以直接参与核酸、蛋白质等的合与组织代。如果含锌元素的酶活性降低，会导致半肌氨酸、赖氨酸等的代发生紊乱，谷氨酸的合成也会减

23、少，肠粘液蛋白和缔结组织蛋白合成过程受阻。 3.锌是各种器官组成的重要成分:锌元素是构成多种蛋白质所必需的，而蛋白质又是人体中各组织器官的物质基础，因此锌是各种器官组成的重要成分。同时，锌离子是一种优秀的无机杀菌剂，锌离子相比于同样具有良好杀菌性的银离子有明显的价格优势。综上所诉，最终确定了以层层自组装技术为手段，将锌离子作为抗菌剂来构建钛合金抗菌涂层并对改性后的钛合金材料的抗菌性进行评估。2 钛合金抗菌涂层的构建2.1简介最近60年以来,研究手段主要是以LB(Langmuir-Blodgett)膜技术16来制备基底片上的纳米结构薄膜。其主要原理为：首先由构成薄膜的物质于液相与气相界面处形成薄

24、层，然后利用相关的仪器使所形成的薄层平铺在目标基质表面形成多层膜。LB(Langmuir-Blodgett)膜技术有许多的缺点，比如完成操作所需要的设备太过昂贵,基质中的种类和尺寸严重影响了材料表面薄膜的稳定性与质量16。为了改进此技术,研究者提出了层层自组装技术,十九世纪八十年代Sagiv在固体基底上构建成了有序的硅氧烷薄膜。接着Decher17以Sagiv的技术为基础,结合正负电荷相互吸引的原理提出了静电层层自组装技术,同时，探究了用静电层层自组装技术在基质表面构建多层多分子薄膜的过程。研究发现层层自组装形成薄膜的原理是以分子界面组装为基础的,首先,处于界面上的分子受时间与空间的限制,很容

25、易产生特定的形态。不仅如此，对许多先进的界面和表面表征技术的顺利运用也非常有利。研究表明通过层层自组装构建的多层膜体系中，可以根据需求调整膜的厚度，接连某些特定功能基团，从而让其具备目标功能和结构39。 层层自组装技术构建多层膜的一般步骤: 首先要对基质进行预处理，然后将膜材料A吸附到基质上完成后清洗基质，接着将膜材料B吸附到基质上，再清洗，最后重复上述步骤。层层自组装技术不仅膜基质没有特殊的要求,同时也不用配备专用的设备,既经济实惠，而且效果较好。层层自组装技术根据驱动力不同,可以分为静电层-层自组装、共价键层-层自组装、氢键层-层自组装等不同类型18。 随着生物医学相关领域研究的飞速发展,

26、人们对复杂生物体中各种生物分子间的弱相互作用从而实现其复杂功能的机制的理解也越发深刻。如某些生物大分子如蛋白质、核酸等复杂的生物功能的形成，是以它们特定复杂三级结构作为基础,这种三级结构是通过了各分子片断之间不同的弱相互作用,来使分子的各个部分自发组装、堆积形成相应空间结构。在各个分子组装相关的研究中,由于自组装体系结构简单，制备起来经济又方便，从而吸引了非常多研究者的目光。如Decher等人在1991年，以LB膜为基础,结合了阴阳离子之间静电相互作用，发展形成的静电层层自组装技术19。从此,静电层层自组装技术成为国际众多研究者的研究热点,随着静电层层自组装技术的日趋成熟，该技术也开始在各个领

27、域中被广泛的运用。层层自组装技术其主要的特点是在其表面带有荷电的基质上通过阴阳离子间的静电相互作用来使阴阳离子聚电解质交替吸附，以此来完成多分子薄膜的构建40。 层层自组装技术有以下优点：1.具备广泛实用的组装分子选择围,比如蛋白质、DNA、多糖 等生物大分子活性物质，同时也能组装一些聚电解质；2此技术制备工艺简单没有特殊要求的设备，只需简单的交替组装实际需要的膜材料即可；3.层层自组装技术对操作条件要求相对简单,可在常温下进行,能够确保生物分子不失去其活性；4.此技术对基底材料的要求简单,适用材料围广泛，并且可以运用于具有复杂结构的器件上。因为该技术具备以上优点，在生物医用材料领域中层层自组

28、装技术得到了广泛地运用19。 2.2材料与方法2.2.1材料与设备1、 直径为1.5cm，厚度为2mm的钛片（西北有色金属研究所订制与加工）。2、 P400、P1000、P2000的砂纸3、 试验中用到的仪器超声清洗机SB32000 （新芝生物科技股份）HH-S数显恒温水浴锅 （金坛市医疗仪器厂）4、 试验中用到的试剂如表1表1 主要试剂试剂简介壳聚糖Sigma Chemical Co. (MO, USA)明胶5mg/mL无水乙醇分析纯川东化工（集团）丙酮市河东区红岩试剂厂醋酸锌溶液10/20/40 mg/mL聚乙烯亚胺Sigma Chemical Co. (MO, USA)2.2.2层层自组

29、装构建涂层0.5 g壳聚糖(CHI)溶解于100 mL2%的醋酸溶液中，明胶(Gel)和聚乙烯亚胺(PEI)分别溶解于去离子水中形成5mg/mL的溶液。首先将阳极氧化处理后的基材，置于匀胶机上。采用旋涂法构建自组装多层膜，2000rpm旋涂速度，20s的旋涂时间。首先滴加一定量的PEI溶液，旋涂，然后滴加去离子水，清洗两次。然后开始层层自组装沉积滴加Gel溶液，旋涂之后，用去离子水清洗两次，然后滴加CHI溶液，继续旋涂，去离子水清洗两次，然后滴加醋酸锌溶液，继续清洗，再加CHI溶液，旋涂，清洗后，完成一个自组装循环，记为PEI/(Gel/CHI)1。不断重复层层制备过程，直到得到PEI/(Ge

30、l/CHI)5，即最终需要的涂层3536。2.2.3表面特征 样品覆盖层的表面形态通过扫描电子显微镜观察（Quanta 200, Philips-FEI Corporation, Netherlands）。其表面元素组成通过配备扫描电子显微镜的能谱仪（EDAX Corporation, U.S.）来研究20。处理过的样品在400-4000nm围的纳米组成由红外光谱仪（model 6300, Bio-Rad Co. Ltd., USA）来测定。获得所有这些光谱数据时分辨率为每4cm-1扫描64次3738。2.2.4涂层耐腐蚀性能测试样品的耐腐蚀性采用AutoLab电化学工作站(瑞士万通公司)进行

31、测定21。测试是在人工模拟体液中进行，采用三电极体系进行电化学测试，以饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，Pt电极为辅助电极，样品作为工作电极。模拟体液的配置：1) 将所需容量瓶、烧杯等器材均用酸泡洗之后用去离子冲洗干净；2) 称量以下所需试剂：5.403gNaCl，0.504g NaHCO3，0.426g Na2CO3，0.225gKCl，0.230g K2HPO4·3H2O，0.311g MgCl2·6H2O，17.892g HPEPS （在100ml0.2M NaOH中溶解），0.293g CaCl2，0.072g Na2SO4。配制1.0M NaOH调pH；（注：以上

32、试剂除HPEPS由Sigma Chemical Co.（MO, USA）提供外，其他试剂均由川东化工（集团）提供）3) 将700ml去离子水倒入烧杯中，加入磁子，于36.5 下在磁力搅拌器上搅拌；4) 将上述所称试剂依次加入；（注：等上一试剂完全溶解后再加下一试剂）5) 用1.0M的NaOH溶液调pH至7.40；6) 将溶液转移至1000ml的容量瓶中，待溶液冷却至20后，加去离子水定容至1000 ml；7) 放置几日后再次测定其pH，并过滤溶液。测试过程：打开电脑和AutoLab电化学工作站，预热5分钟；接好电极；在Gpes软件中选择Method，Linear sweep voltametr

33、y，Normal； 设定参数如起始电位、静止时间与灵敏度等；开始测试；保存数据，格式为.ocw；对数据进行分析，AnalysisTafel Slope AnalysisTafel Slope，得到腐蚀电位和腐蚀电流密度； 在Origin 8.0中作图。2.3结果与讨论2.3.1涂层分析图1 扫描电镜图 (a)是未处理的钛材；(b)、(c)和(d)分别是以10、20和40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材。首先利用扫描电镜对钛材的表面进行了表征，如图1所示，从图中可以看出未经处理的钛材和在10、20和40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后的钛材表面的表征结构。图1中(a)是未

34、处理的钛材，其表面粗糙不平整，造成钛材表面不平整的原因可能是钛材在打磨的时候没能使钛材表面处理光滑；也有可能是在对钛材清洗时不彻底，导致钛材表面残留有杂质，在扫描电镜下表面粗糙不平整。观察图(b)、(c)和(d)（分别是以10、20和40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材）发现钛材表面逐渐趋于平整此结果说明醋酸锌溶液在钛材表面成功的进行了层层组装。由于(b)、(c)和(d)的平整度变化说明了随着醋酸锌溶液浓度的增加层层自组装的效果更佳。观察40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材的能谱图，如图2，从图中可知涂层中主要含有钛、锌、氮、金这几种元素。锌元素的出现说明了实验成功

35、的将锌离子通过层层组装处理构建于钛材表面。而金元素的出现是因为在对钛材进行检测时，对其表面进行了喷金的操作。图2以40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材的能谱图表3展示了以40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材的表面化学组成与元素的具体含量;其中钛元素（Ti）含量为82.84%，金（Au）元素的含量为6.51%，锌（Zn）的含量为3.29%，氮(N)的含量为7.36%。表3 以40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材的表面化学组成基材Ti(wt %)Au(wt %)Zn(wt %)N(wt %)Ti-LBL(Zn)82.846.513.297.362.3.2结

36、论本实验利用层层自组装技术成功地将锌离子构建到钛材表面，使得心离子粘附在钛基植入材料表面形成一层含锌离子的薄膜，改变了钛基植入材料的表面特性；并尝试将其应用于外植体表面抗菌涂层的研究，因为锌离子具有杀菌能力当其通过层层自组装技术黏附在钛基植入材料表面，所以钛材料获得了抗菌能力。利用扫描电镜、EDS能谱等对钛材表面涂层的结构和表面形貌进行表征并测定了改性后钛材表面化学组成与其元素含量，证实了在材料表面形成了含锌离子薄膜。实验研究表明，层层自组装技术在钛材表面建立含锌离子的抗菌涂层时，锌离子的浓度是可控的，我们可以根据实际需求来实现对钛材表面的改性。3 改性后钛材的抗菌能力评估3.1简介钛合金由于

37、其优良的力学性能与耐腐蚀性，同时兼具有良好的生物相容性，使钛合金成为了当下临床骨组织修复和替代使用的重要材料。然而，术后感染成为临床应用中医疗设备植入失败的常见原因之一。外植物表面的细菌粘附是引起外植物感染的主要原因。材料表面引起的感染往往会导致外植物过早松动和脱落，并可能诱发邻近组织和器官的感染严重时甚至会使组织和器官坏死，给患者带设备反复植入的痛苦和严重的经济负担。钛材料也面临同样的难题，近年来，随着钛合金材的植入物表面改性方法的广泛研究，在钛合金表面引入相关的有机或无机物质实现对钛合金材表面进行针对性的改性，从而改善钛合金植入物的缺陷，使钛合金材料更加符合人们需要的需要22。研究发现,刚

38、进行植入手术后最容易引发感染。金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞杆菌在医院分布最为广泛，也是引发术后感染的主要病原菌。铜绿假单胞杆菌和金黄色葡萄球菌都具备较强的化学药物抵抗能力。近年来由于滥用抗生素，这两种菌的耐药性越来越高23。随着感染菌的耐药菌株的不断产生，药物的效果逐渐减弱，导致了患者术后费用越来越高，但患者的病痛却并没有得到有效的治疗。本实验通过纳米锌抗菌涂层的钛材在金黄色葡萄球菌上进行的一系列抗菌测试，来验证通过涂覆纳米锌的钛材是否具有了目标改性功能，对表面改性后的钛材的抗菌性进行评估，检测材料是否具有优良的抗菌性能34。3.2材料与方法3.1.1材料与设备材料：金黄色葡萄球菌菌株（大学生物

39、工程学院），肉汤培养基（日水生物技术，MH肉汤，配制比例21g/L H2O），cck-8试剂（购于碧云天生物技术研究所，产品编号C0038）实验仪器：1) CO2培养箱 （SHELLAB）2) 培养瓶 （Greiner）3) TL-16R台式高速冷冻离心机 （伟业仪器厂）4) 超净工作台 （博讯实业医疗仪器设备厂）5) 数码相机 （C5050 型，OLYMPUS）6) 倒置相差显微镜 （IX71 型，OLYMPUS）7）酶标仪：Model 550，美国BIO-RAD 公司3.1.2细菌的培养在本次研究中，我们使用金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，是人类的一种重要病原菌，在与其斗争

40、的历史中，因为抗生素的滥用，使的这种菌的耐药性越来越强，一般的小剂量抗生素对其起到的效果非常微小，而术后的患者本身的抵抗力降低，无法大量的使用高剂量的药品，不然会给患者带来巨大的痛苦甚至生命危险25。因此如何使植入物本身带有一定的抗菌能力，并降低术后的感染，成为了当今研究的热点。因本次实验中，我们所使用的金黄色葡萄球菌菌株是放入冰箱中进行了冻存的菌株，在进行下面一系列的抗菌性能测试实验前，我们先要先对菌株进行活化操作，然后培养成复壮后的菌株，才能进行研究。而菌株活化操作的是否成功也将影响到我们后面的结果的准确性，因此这一步操作是非常重要的。菌种的保藏和复是我们进行菌株实验中经常接触到的东西，因

41、为菌种是我们生物类专业这种从事微生物学以与生命科学研究中最为基本的科学研究材料，特别是相关的使用微生物进行有关的研究实验或生产离开菌株是不能进行下去的，因此菌种也是国家的一种重要资源26。菌种保藏的主要原理是根据所需要保藏的微生物的生理生化特点，并对其保存的环境进行针对化的改造，创造一种使微生物代处于不活泼、生长繁殖受抑制的保存环境，对于环境的改造我们可以采用的方法有低温、干燥、缺氧这3种27。通过这些手段的使用，我们可以使菌种暂时处于休眠状态，降低它的生物活性。本次实验中，我们的菌株是存放在低温干燥的冰箱中进行保藏的，所以我们在对菌株复时，首先我们将冷冻的菌种解冻，即将所需的菌种从保藏状态的

42、温度恢复到室温状态，这一步我们可以将菌株放入30-40的水浴锅中1-2分钟，或者将装有菌株的保存管放在手中进行反复搓动，利用体温同样可以达到水浴锅的效果39。在恢复室温后，将菌株接种在合适的培养基上进行2-3代的培养即可将菌株恢复到保藏前的活性。而本次实验中，我们所使用的菌株是保存在低温干燥的冰箱中，温度并不是特别低，所以在传代复时，我们只需要进行1-2次的传代即可将菌株的活性恢复。恢复后制备菌液我们就可以进行下面一系列的实验了。金黄色葡萄球菌菌液的制备：在接种菌株之前，首先要按一定的比例(MH肉汤，21g/L H2O)配制好实验所需的肉汤培养基，配制完成后，为确保实验这个过程的没有其他的杂菌

43、污染，所以要将培养基放入高压灭菌锅灭菌30min，灭菌后可以放入4的冰箱中进行冻存备用。接种前，将超清工作台提前打开用紫外灭菌15min，将菌株从冷藏箱中取出后，我们把装有菌株的冻存管放入手心进行搓动，在肉眼下看到冰冻的菌液化开形成液体即可停止，在超清工作台将金黄色葡萄球菌接种到肉汤培养基中，接种完成后，放入37的摇床，设置转速为100rpm，培养24小时，即可得到抗菌测试所需的金黄色葡萄球菌悬液。接种后的冻存管用新的封口膜封口，重新放入冰箱，以便下次使用28。3.1.3细菌电镜样品的制备1） 将经过待测钛片放入24孔板中，每孔加入0.9ml细菌密度为1×106cells/cm2的肉

44、汤培养液。2） 将24孔板放入37培养箱中培养24小时，除去培养液并加入PBS缓冲液放置于水平转摇床上清洗3次，每次5分钟。3） 吸出PBS缓冲液并向每孔加入质量体积比为4的多聚甲醛溶液在4下固定30分钟。4） 去除多聚甲醛溶液，每孔加入0.5mlPBS缓冲液放置于水平转摇床上清洗2次，每次4分钟。5） 随后进行梯度脱水，依次加入20、50、80、100的乙醇/PBS混合液每次脱水10分钟。6） 每孔加入0.3ml叔丁醇置换残留在细胞的乙醇，放入37培养箱中孵育10分钟。7） 10分钟后吸出叔丁醇将样品放入冷冻干燥机中干燥12小时。8） 对样品进行喷金处理，而后再电子显微镜下观察。3.2抗菌性

45、能测试3.2.1抑菌圈实验抑菌圈实验法是对杀菌剂、防霉剂的作用效果进行测量的一种方式，主要用于测定所需的杀菌剂或防霉剂对细菌、霉菌、酵母菌的杀菌抑制作用，它是一种简单有效的定性或半定量的方法。这种实验方法主要是通过杀菌防霉剂在适当的琼脂平板上的扩散能力来初步的对试剂的杀菌抑制作用进行简单的测量，进而得知这种杀菌剂的杀菌能力，并对以后的实验提供改进的数理依据。这种实验方法的基本原理和步骤是，根据我们需要研究的对象菌种，提前将试验菌铺好平板，在已接种供试菌的琼脂培养基上，均匀的铺上实验用的少量杀菌剂，使杀菌剂和培养基表面接触，在培养基的表面杀菌剂和试菌相互接触作用。在一定温度下培养一定时间后，由于

46、杀菌剂在培养基表面上的渗透扩散作用，涂抹了杀菌剂的部位会因为杀死了病菌而抑制了其在培养基上的生长，在其周围出现一圈规律的空白圈，这就是抑菌圈。通过以前的研究，我们可以得知在一定围，抑菌圈的直径与药剂浓度的对数呈直线函数关系，因此我们可以从抑菌圈的直径上进行数据分析，就能得到对供试样品杀菌活性大小的评估28、29。由于金黄色葡萄球菌在环境中的广泛存在，而且它是人类的一种重要病原菌，人们对它的生长特性和形态已有过大量研究，因此利用其检测上面经过改性的钛材料样本的抗菌性能。抑制圈实验参照相关文献进行(Zhiyong, Fanet al. 2006)。实验过程：首先将上面制备好的改性钛片经过紫外照射，

47、把钛片的两面都进行灭菌，灭菌时间为120分钟。对制备好的金黄色葡萄球菌悬液在紫外分光光度计下进行测量OD值（本次实验中测得的OD值为0.0105、0.0095、0.0102，平均菌液浓度为1×107c/ml，所以我们对原菌液稀释了10倍），测的OD值后，对悬液进行稀释，让细菌悬液的数量级变成106细胞/ml，然后取20ul的细胞悬液置于培养皿上，将悬液涂匀，把样品轻轻放置于琼脂板上（轻轻按压钛片即可，否则琼脂板会破裂），将培养基放在37下培养24小时后即可观察。而我们的对照组则为和样品一样但没有经过层层自组装技术处理的纯钛片，对照组的实验方案和样品一样3033。3.2.2抑菌率实验首

48、先，我们同样要对样品进行紫外灭菌处理，正反两面灭菌120分钟。然后将实验组的样品和对照组的纯钛片放进24孔板里面，然后在每个孔中加入20ul的细菌悬液，然后在加入2ml的新培养基，放在37的培养箱中过夜培养。经过过夜培养后，因为细菌会在样品上粘附贴壁，所以在这里我们利用了超声震荡仪对孔板进行了震荡，这样可以让细菌从钛片上脱落下来，而且能过是菌液混合均匀,超声时间为20s，否则细菌容易被破坏。在将细菌洗脱下来后，我们对每个孔板的菌液都取20ul，将其置于各个平板放与37的培养箱培养24小时，最后对平板的菌落数进行计数，并计算抗菌率即可。抑菌率的公式如下：C：代表抑菌率A：为对照组的菌落数B：为实

49、验组的菌落数3.2.3材料耐受性测试将经过不同修饰的钛片放入24孔板中，每孔加入1ml的含有培养液的细菌密度为1×106cells/ml的菌液。然后将孔板放在37的培养箱中培养12小时。12小时后，每孔再加入200ul的无菌培养基和10ul的cck-8溶液，并在37的培养箱中培养1小时。1小时后，取一新的96孔板，将24孔板中的菌液每孔吸取50ul置入96孔板中，在450nm波段测量吸光值3132。3.3 结果与讨论3.3.1电镜分析图1 扫描电镜图 (a)是未处理的钛材；(b)是以40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材。 将培养好的金黄色葡萄球菌制备成电镜样品在扫描电镜

50、下观察得到如图1，结果显示未处理的钛材表面有明显的细菌存活，而以40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材表面没有细菌存活。3.3.2抑菌圈实验分析 抑菌圈实验结果如图2所示，图2中（a）为未处理的钛材，（b）为以40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材，从图中可以明显看出，经过改性的钛材出现了明显的抑菌圈，证实了以40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材在抗菌能力上得到了显著的增强。图2 抑菌圈（a）未处理钛材；（b）(b)是以40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材。通过上面抑菌圈的实验，我们可以得知经过层层组装处理后钛材的抗菌能力大大的提高了。但具体

51、的抗菌能力我们还仍然需要通过抗菌率和CCK-8的实验来测试。通过对平板上菌落的计数，我们得到了表1的数据，通过表格中数据可以得知，未处理的钛材（对照组）的平均菌落数为4101，而我们经过层层组装处理的钛材（实验组）的平均菌落数为440，计算后可知抑菌率为89.27%。所以在抑菌效果上，构建了锌离子涂层的钛材料在抑菌效果上是有了很大的提升的。也说明了锌离子作为灭菌剂，其对细菌有很强的灭杀抑制效果。而且我们可以通过提高醋酸锌溶液的浓度，来使钛材表面上粘附的锌离子更多，从而让钛材具有更高的抑菌率。表1 为40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材的抑菌率样品Ti （菌落数）Ti-Zn2（菌落

52、数）抑菌率 （%）1451250188.902387944288.613391237890.03CCK-8（全称为Cell Counting Kit 8）是一种综合能力很好的细胞活性检测试剂，而利用CCK-8试剂检测的方法就是CCK-8实验了。这种试剂的检验原理是因为CCK-8试剂中含有WST-8。WST-8在电子载体的作用下能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色的甲臜物，生成的甲腊物的数量与活细胞的数量成正比，通过酶标仪测量细胞液的吸光度值，便可检测出待测细胞样品的活性。与传统的MTT相比，CCK-8法具有很懂优点，例如实验步骤少、操作简单、灵敏度高、实验结果更准确、可重复性好

53、。本次实验中我们将利用CCK-8法对改性的钛材进行耐受性测试，进而对改性后的钛材的表征得到更全面的了解。材料耐受性测试的结果如图3所示，从图中对比未经过处理的钛材与经过40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后的钛材。可以得知，经过改性的钛材表面金黄色葡萄球菌的耐受性是降低了的。这说明了层层自组装技术构建锌离子抗菌涂层后的钛材在对细菌的抑制能力上具备了高效持久的抗菌性能。对比(c)和(d)可以看出当锌离子浓度达到40 mg/mL时，抗菌能力接近饱和，此时再想通过增加锌离子浓度增加材料的抗菌性已经不可能了。综上所述锌修饰后的钛材是具有在临床中应用的可能性的。图3 耐受性实验（CCK-8实验）

54、(a)是未处理的钛材；(b)、(c)和(d)分别是以10、20和40 mg/mL的醋酸锌溶液进行层层组装处理后钛材。3.4 结论通过醋酸锌溶液进行层层组装处理后的钛材进行一系列的抗菌能力测试，我们可以知道，通过锌修饰的钛材在抗菌性能上得到了巨大的改善。抑菌圈实验中可以看到明显的抑菌圈出现，而在抑菌率实验过数据分析，得知修饰后的钛材抑菌率达到了89.27%，对比未经处理钛材的对照组，抑菌效果相当明显。而通过CCK-8实验，醋酸锌溶液进行层层组装处理后的钛材耐受性明显优于纯钛，细菌的增值速度降低。通过对比图3中(c)和(d)可以看出当锌离子浓度达到40 mg/mL时，抗菌能力接近饱和，此时再想通过

55、增加锌离子浓度增加材料的抗菌性已经不可能了。从各项实验来看，改性后的钛材在抗菌性能上大大的优于未经任何处理的钛材。4 总结4.1 全文综述本研究中首先利用层层自组装技术在钛材表面构建含锌离子涂层，使锌离子作为无机抗菌剂均匀分布在钛材料的表面。当锌离子大小达到纳米级的时候，锌离子对菌的灭杀抑制作用将得到更大的提升，因此以较低的效应浓度来达到非常好的抗菌效果。而且因为锌本身的广谱抗菌能力，保证了在只经过锌一种抗菌剂修饰后的钛材也能具有很强的适应性。在对不同表面改性处理后的钛材抗菌能力进行表征与测试后，本实验主要得出以下几个结论：1) 钛材表面锌离子抗菌涂层的制备：采用了醋酸锌溶液通过层层自组装技术

56、在钛材料表面构建含锌离子抗菌涂层，实验利用了扫描电镜、EDS能谱等对涂层的结构和表面形貌进行表征和分析。通过对材料表面化学组成与元素含量分析证实了在材料表面成功构建了含锌离子的抗菌涂层。本次实验还对改性后钛材的抗腐蚀性进行了评估,结果显示改性后钛料的抗腐蚀性能显著增强，生物相容性得到了进一步的完善。2） 改性后钛材的抗菌能力：以金黄色葡萄球菌在改性后的钛材表面进行抑菌圈实验、抑菌率实验，结果显示改性后的钛材形成明显的抑菌圈,钛材的抑菌率为89.27。实验结果证实了改性后的钛材料在抑菌能力上得到了显著的改善，抑菌的效果非常的明显，达到了本次研究所想要的数据。而CCK-8实验则表明了，改性后的钛材在对细菌的耐受性上是优于纯钛的，它使得细菌的增殖能力降低了。本研究采用了层层自组装技术在钛材表面成功构建了含锌离子的抗菌涂层，完成了对钛合金基质进行功能性的表面修饰，增强了材料的抗菌性。实验结果向