血红素氧合酶

1、血红素氧合酶【关键词】 血红素氧合酶摘要：目的 探讨血红素氧合酶1(HO1)对肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法 将大鼠随机分为：正常组(N组)、硬化组(LC组)、假手术组(S组)、手术组(I/R组)和给药组(I/R+hemin组)。除正常组外其余各组大鼠皮下注射体积分数为40%的CCl4溶液，每周2次，11周后形成肝硬化模型；停药1周后进行肝脏缺血再灌注；于再灌注后6h检测肝功能、抗氧化能力，免疫组织化学检测核转录因子(NFB)、天冬半胱酶(caspase3)和HO1蛋白的表达。 结果 给予hemin诱导HO1高表达能减轻肝脏缺血再灌注后肝细胞损伤，提高锰超氧化物歧化酶(MnSOD

2、)水平，降低caspase3、NFB阳性表达。结论 HO1能有效地减轻肝硬化肝脏缺血再灌注损伤，其机制可能与提高MnSOD水平、降低caspase3及NFB表达有关。关键词：血红素氧合酶1；肝脏缺血再灌注；NFB；caspase3Protection of heme oxygenase1 against hepaticischemia reperfusion injury in cirrhotic ratsABSTRACT: Objective To study the proctective effect of heme oxygeanse1(HO1) on cirrhotic rats a

3、fter hepatic ischemia reperfusion injury. Methods All the rats were randomly divided into 5 groups as follows: normal group(N), liver cirrhosis group (LC), sham operation group (S), ischemia reperfusion group (I/R), and I/R+hemin group. Except for N group, the other groups were injected with 40% CCl

4、4 twice a week. After 11 weeks, the model of liver cirrhosis was formed. The segmental (70%) hepatic ischemia reperfusion operation was carried out one week later. The animals were sacrificed 6h after reperfusion. Blood was collected to measure the liver function, antioxidative ability, NFB and casp

5、ase3, and HO1 expressions were studied by immunohistochemistry method. Results Administration of hemin to induce high HO1 expression could lessen hepatic injury, increase MnSOD enzyme level, and decrease caspase3 and NFB expresssion. Conclusion HO1 plays an important role in protecting liver cirrhos

6、is against ischemia reperfusion injury by increasing MnSOD enzyme level and decreasing expression of caspase3 and NFB.KEY WORDS:heme oxygenase1; hepatic ischemia reperfusion; NFB; caspase3上消化道大出血、肝脏外科手术等过程中都经历肝脏缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)损伤这一临床常见的病理变化过程。肝硬化时肝脏对缺血再灌注损伤更加敏感。近年人们发现血红素氧合酶1(heme oxy

7、genase1, HO1)对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用1。本实验采用大鼠肝硬化肝脏缺血再灌注模型，观察诱导HO1表达后肝组织caspase3、核转录因子B(nuclear factorkappB, NFB)及HO1的变化，探讨HO1对肝硬化肝脏缺血再灌注的保护机制。1 材料与方法1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠，体重200-250g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。将大鼠随机分为：正常组(N组)、硬化组(LC组)、假手术组(S组)、手术组(I/R组)和给药组(I/R+hemin组)。正常组和硬化组：入腹后直接取血和肝组织，不阻断肝门血供。假手术组：入腹后只分离肝十二脂肠韧带，不

8、阻断肝门血供。手术组：游离肝十二脂肠韧带，分清供应肝左叶和中叶的肝蒂，肝脏缺血30min，再灌注6h。给药组：术前24h和12h给大鼠腹腔注射氯化铁血红素(hemin)，每次0.3mmol/kg(30mol/100g)，其余操作同手术组。其他各组给予等量生理盐水腹腔注射。正常组每组6只大鼠，其余各组或亚组9-12只大鼠。1.2 主要试剂 CCl4分析纯购自西安富力化学厂，橄榄油分析纯购自国药集团化学试剂有限公司，hemin购自美国Sigma公司，超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，抗大鼠NFBp65、caspase3和HO1一抗购自武汉博士得生物工程

9、公司，即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。1.3 模型制备1.3.1 肝硬化模型的制备 除正常组外其余各组大鼠皮下注射体积分数为40% CCl4溶液(由2份CCl4和3份橄榄油混合而成)，首剂5mL/kg，以后每次3mL/kg；正常组大鼠皮下注射等体积生理盐水，每周2次，共11周。随机抽取大鼠做肝组织HE染色和Masson染色证实肝硬化形成，造模成功后1周用于实验。1.3.2 肝脏缺血再灌注模型的制备 大鼠术前禁食12h，氯氨酮(0.8g/kg)腹腔注射麻醉大鼠，上腹正中切口，游离肝十二指肠韧带，用无创微血管夹夹闭供应肝左叶和肝中叶的肝动脉、门静脉及

10、胆管，造成70%肝脏缺血。不阻断肝尾叶和肝右叶血流，以防门静脉和胃肠道淤血。30min后松开微血管夹恢复肝脏灌流，关腹后独笼饲养。1.3.3 hemin溶液的配制 称取少量hemin，溶于0.1mol/L NaOH溶液中，再用1mol/L HCl调pH至7.4，最后用生理盐水稀释至终质量浓度5g/L。临用前新鲜配制，避光保存。1.4 实验方法1.4.1 采集标本 各组动物实验结束后，再次麻醉大鼠，二次开腹，取下腔静脉血6-8mL，常温下1500r/min离心5min，取血清低温保存。取左叶肝组织约0.4cm0.5cm1.0cm固定于40g/L多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，5m厚连续切片。1.4.2

11、 血清学检查 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)由本院生化室全自动生化分析仪测定。MnSOD、MDA采用南京建成公司SOD、MDA检测盒进行测定。1.4.3 免疫组织化学检测及结果判定 肝组织石蜡切片采用即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒检测NFB、caspase3和HO1蛋白的表达。一抗工作浓度分别为1300、1100和1100。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为空白对照，用已知阳性反应的组织作为阳性对照。采用德国LEICA公司的QWin550CW图像信号采集与分析系统对切片阳性部位进行灰度分析，灰度值越低，表明蛋白表达量越高。1.5 统计学处理 所有数据均用均数标

12、准差(s)表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行单因素方差分析，以全体P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 血清ALT、AST活性测定 LC组血清ALT、AST活性较N组明显升高(P0.01)。肝脏缺血再灌注6h后，I/R组、I/R+hemin组血清ALT、AST活性迅速升高，与S组相比差异均有统计学意义(P0.01)。I/R+hemin组与I/R组相比，酶活性降低，其差异也具有统计学意义(P0.01，表1)。2.2 血清MnSOD、MDA含量测定 与N组比较，LC组MnSOD水平降低，MDA水平升高(P0.01)。肝脏缺血再灌注后6h时I/R组及I/R+hemin组MnSOD均低

13、于S组，MDA高于S组(P0.01)，但给予hemin再灌注后MnSOD水平高于同期I/R组，MDA水平低于I/R组(P0.01,表1)。表1 肝脏缺血再灌注6h时血清学指标（略）Table 1 The level of serum enzymes after 6h of hepatic ischemiaN: normal group; LC: liver cirrhosis group; S: shamoperation group; I/R: ischemia reperfusion group; I/R+hemin: given hemin before ischemia reperfusion group; #P0.01 vs. N group; P0.01 vs. S group; P0.01 vs. I/R group2.3 肝组织NFB、caspase3免疫组化结果 NFB、caspase3在N组肝组织中几乎没有表达，在LC组和S组呈弱阳性表达。肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注后6h，I/R组NFB、caspase3表达比S组明显升高(P0.01)。I/R+hemin组再灌注6h时NFB、caspase3表达比同期I/R组明显下降(P0.01，表2、图1、图2)。2.4 肝组织HO1免疫