利用核磁共振同时观测大鼠心室内压参数与能量代谢

1、利用核磁共振同时观测大鼠心室内压参数与能量代谢    利用核磁共振同时观测大鼠心室内压参数与能量代谢    生理学报 1999年第6期第51卷     杜泽涵；冯锐；冯光玉军事医学科学院国家生物医学分析中心；北京；100850)；程增江；现工作单位；解放军总医院微量元素研究室；邮编100853；Tel:E-mail:Trace；李红昕；山东省立医院心外科；济南；250021；董华进；军事医学科学院毒物药物研究所；北京100850；700；程增江；杜

2、泽涵；李红昕；董华进；冯锐；李光玉    关键词：核磁共振；离体心脏；能量代谢    摘要：本文介绍一种在核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)谱仪上对大鼠心室内压参数与能量代谢同时测定的技术。 该方法采用离体等容大鼠心脏模型, 通过计算机心功能监测系统测量和分析心脏的心室内压参数, 通过测定心脏的磷-31核磁共振(31P NMR)谱观测心肌组织的能量代谢状态。    自70年代开始, 核磁共振(nuclear magnetic reson

3、ance, NMR)技术被用于生物医学领域的研究并得到迅速发展。 NMR作为一种非损伤性的测定技术, 不仅可以从分子水平上对完整器官或组织细胞内的多种能量代谢物质, 如磷酸肌酸(PCr)、ATP、无机磷酸盐(Pi)以及细胞内的pH值进行连续动态观测, 而且可在接近正常生理状态的情况下实现对同一功能器官(如心脏)的生理功能与能量代谢的实时同步测定。 因此, NMR这技术已成为心脏病理生理学研究领域中一项十分有用的工具1,2。 在国内, 虽已建立有离体心脏的NMR检测技术3,4, 但尚未见有对心脏的功能与能量代谢同时进行测定的报道。    实现心脏功能与代谢

4、的同时观测, 需要在NMR谱仪的周围安装心功能观测装置, 并在原本狭窄的磁体腔中增加管线, 因而使得实验操作的难度进一步加大。 利用简单的Langendorff逆灌心脏模型虽然能在NMR谱仪上测定心肌的能量代谢状态, 却难以准确反映心脏的血流动力学情况5; 工作心脏能够模仿心脏的生理做功, 但由于装置复杂, 在NMR谱仪上操作较为困难2。 建立计算机心功能数据采集与分析系统, 可使实验中心功能的检测和分析自动化, 并实时显示心室内压参数。 然而, 目前国内尚缺少用于离体心脏特别是等容心脏模型观测使用的分析软件。 为此我们选用Langendorff等容心脏模型, 对文献报道使用的灌流实验装置进行

5、优化, 并开发了相应的心功能软件。 利用本系统, 一个人即可进行整个实验操作和测定, 实验后能很快得到一份实验中心室内压参数和能量代谢变化的数据报告。            实验操作Wistar大鼠, 260300 g, 麻醉后迅速开胸, 除去胸腺, 分离主动脉, 在右心室肺动脉根部剪一切口,立即于主动脉根部上方0.5 cm处做一半圆形切口并迅速插入主动脉导管, 使心脏联于灌流装置上, 结扎固定好后开始逆行灌流。 灌流液组成(mmol/L): NaCl123, KCl 5.9

6、, MgSO4。7H2O 1.5, naHCO3 20, EDTA-2Na 0.5, 葡萄糖11.1。 向灌流液中持续通以95% O2和5% CO2的混合气体(1.2 L/min), 气体经G3垂熔漏斗“破碎”分散后与灌流液充分接触, 氧合后的灌流液pH 7.4(37)。 将肺以及心脏周围的血管及结缔组织除去,使心脏离体。 用16号针头在左心室尖部扎一小孔, 用以排出由Thebesian静脉回流至心室的液体。 再在左心耳中间剪一小口, 从该口处将充水的、头部带一薄壁乳胶小球的塑料导管(?=1.5 mm)经二尖瓣插入左心室, 并于左心耳处结扎固定。 插入导管前先将乳胶球中的水(100 l)转至三

7、通阀上的注射器中, 待乳胶球到达左心室合适位置后, 将注射器中的水再充入乳胶球中。导管的另一端经三通阀与压力传感器相联, 信号放大后经模/数(A/D)转换接口, 由计算机对心室内压参数进行采集与分析。 采用CARDIO 2左心室内压分析软件实时测量指标:收缩压, 舒张末期压(LVEDP), 左心室发展压(left ventricular developed pressure, LVDP), 室内压最大上升速率(+dp/dtmax),室内压最大下降速率(dp/dtmax), 心率(HR)以及心率室内压乘积(rate and pressure product, RPP)。用量筒定时收集1 min内

8、由蠕动泵排出的冠脉流出液作为冠脉流量。    将制备好的灌流心脏固定在外径为25 mm的测试管中, 置于磁体中探头线圈处并按前文3,4所述方法进行NMR测定。 仪器及主要参数:日本JEOL GX-400 NMR谱仪, 立式窄孔磁体, 25 mm标准磷探头, 31P 共振频率为161.83 MHz。 采用4 k数据点, 谱宽10 kHz。 不锁场, 调匀场至水的 1H信号半峰宽达70100 Hz。 单脉冲序列非去偶方式测定, 脉冲倾角45°,脉冲宽度55 s, 脉冲间隔0.7 s, 每个谱累加5 min 380次。 采用指数窗函数, 线增宽因子3

9、0 Hz。 在样品管中与心脏平行的位置贴管壁放一亚甲基二磷酸(MDP)外标毛细管,各共振峰的峰强度以毛细管中的MDP作为相对标准, 将PCr的化学位移定为零。    实验装置图1是进行心脏室内压参数与能量代谢同时测定的实验装置示意图。 图中,1. K-H液贮液瓶。 2. 电磁阀, PQ22DF型。 由电子继电器控制其开闭, 通过在氧合器固定液面位置的导线触点,自动维持灌注压的恒定。 3. 95 O2和5 CO2混合气体。 4. g3砂芯垂熔漏斗。 混合气体经过该漏斗可被充分分散, 达到很好的氧合效果。 5. 氧合器。灌流液在此氧合, 同时调节灌流液液面高

10、度可控制灌注压, 我们固定灌流液液面高度110 cm以维持恒定的灌注压10.8 kPa。 6.恒温(37.5)循环水。 用以保持到达心脏的灌注液的温度达到37。7. 绝缘套管。 用以减少灌流液到达心脏时与周围空气的热交换。 8. NMR样品管, 外径25 mm。 9. 大鼠心脏。 10. 充水乳胶球。 用北京乳胶厂硫化胶乳液和陶土粘合剂制成, 有很好的顺应性。11. 标准25 mm 磷探头。 除激发和接收NMR信号外还可通过发送热空气流使心脏周围液体温度保持37±0.2。12. 超导磁体。 13. 蠕动泵。 HL-3型, 上海沪西仪器厂。 用以抽出样品管中超过心脏上方0.5 cm的液

11、体。 14. 冠脉流出液。 15. 三通阀。 可使乳胶球与压力传感器或注射器相通。16. 1ml注射器。 17. 压力传感器。 YH-1型, 购自北京航天航空医学研究所。 18. 血压放大器。 xY-1型, 购自上海嘉龙教学仪器厂。 19. 计算机心功能监测系统。 包括模/数(A/D)转换器(上海嘉龙教学仪器厂)、586微机和CARDIO2左心室内压分析软件。 20. 谱仪计算机。 控制谱仪和处理探头接收的信号。               &#

12、160;    图1等容大鼠心脏NMR测定用灌流装置    fig.1NMR isovolumic rat heart perfusion aparatus    1. Perfusate container; 2. Electromagnetic valve; 3. 95 O2+5 CO2; 4. G3 sand funnel; 5. Bilayer oxygened perfusate container; 6. Thermostatic circulating wate

13、r; 7. Insulation bushing; 8. NMR sampling tube; 9. Rat heart; 10. Water-filled latex balloon; 11. 25 mm 31P NMR probe; 12. Superconductive magnet; 13. Peristaltic pump; 14. Coronary effulent; 15. 3-Way valve; 16. Syringe; 17. Pressure transducer; 18. Blood pressure amplifier; 19. Computerized cardia

14、c function monitoring system; 20. NMR spectrometer computer.    图2为一等容大鼠心脏灌流开始2025 min和115120 min时测得的 31P NMR谱图, 对于其中的谱峰我们已根据文献做了归属3。        图2等容大鼠心脏的 31P NMR谱图    fig.231P NMR spectrum of a isovolumic rat heart during 2

15、025 min and 115120 min perfusion periods    图3为等容大鼠心脏在2 h灌流过程中心室内压参数和高能磷化物水平的变化情况, 其中PCr和ATP的相对峰强度以灌流开始后2025 min所记的第一个谱中的数据作为100%。 从中可见, 在90 min灌注期内, 主要心脏功能和代谢参数较为稳定, 但随灌注时间延长, LVDP, RPP, PCr 以及CF等指标有较大下降。 实验过程中使用无磷灌流液可能是影响心脏功能和代谢稳定的重要原因之一。      

16、0; 图3等容大鼠心脏在2 h灌流过程中主要心室内压参数和高能磷化物的变化    Fig.3Changes of hemodynamic parameters for LVDP, HR, RPP, CF, +dp/dtmax and high-energy phosphates for PCr and ATP in isovolumic rat heart preparations sampled at 5 min intervals during 2 h perfusion    注意事项与评价(1)本

17、文报告的灌流实验装置简便、易于操作。 用电磁阀能自动维持恒定的灌注压, 灌流液采用循环水加热并用绝缘套管保温,加上探头的热空气流可有效地保持心脏恒定的实验温度。 将灌流液的氧合和热交换装置固定在磁体外, 通过乳胶导管将灌流液送至心脏, 将测压导管、灌流液导管以及冠脉流出液导管在磁体内的部分捆绑在一起, 这样心脏在插入主动脉导管及心内压导管并固定于样品管后可方便和灵活地移入和移出磁体。 (2)为避免来自灌流液中较高的Pi信号对细胞内pH测定的干扰, 宜采用不含磷酸盐的灌流液。 如不需要测定心肌细胞内的pH值, 则宜采用含磷酸盐的灌流液, 以使心脏在实验过程中保持较好的稳定性。 (3)心脏悬于空气

18、中会造成较大的气/液界面, 从而破坏磁场的均匀性导致谱线增宽, 分辨率及灵敏度降低, 宜将心脏浸于冠脉流出液中进行测定, 一般使液面在主动脉根部上方0.51 cm为宜。 (4) 用“CARDIO 2 左心室内压分析软件”可实时显示心脏的心室内压参数, 引入LVDP和RPP参数可以很好地反映心肌绝对收缩幅度和心室做功的大小。 (5) 对大鼠体重250 g以上的心脏, 每个谱累积5 min可获得足够好的信/噪比。 为考察心脏功能与代谢之间的关系, 可以在NMR谱图采样的中间用心功能软件记录心脏的心室内压参数。    *“九五”军队卫生科研基金资助项目 (No

19、.96M042)    *联系人杜泽涵, 电 E-mail:nmrl    作者单位：杜泽涵冯锐李光玉军事医学科学院国家生物医学分析中心, 北京 100850)    程增江现工作单位: 解放军总医院微量元素研究室, 邮编100853, Tel: E-mail:Trace李红昕山东省立医院心外科, 济南 250021董华进军事医学科学院毒物药物研究所 北京100850700    

20、*Supported by the Foundation of Military Medical Research (No.96M042)    corresponding author: Tel E-mail:nmrl1Present address: Trace element Laboratory, 301 Hospital, Beijing 1008532Heart Surgery, Shandong Hospital, Jinan 2500213Institute of Pharmacolgy and Toxicol

21、ogy, Amms, Beijing 100850    参考文献    1Gorman MW, He MX, Sparks HV, et al. Adenosine formation during hypoxia in isolated hearts: effect of adrenergic blockade. J Mol Cell Cardiol, 1994, 26 (12): 16131623.    2Cheng ZJ (程增江), Du ZH (杜泽涵). Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectroscopy of isolated hearts. Bopuxue Zazhi (波谱学杂志), 1997, 14 (1): 8998 (in Chi