探讨改良线栓对局灶脑缺血模型制备的影响

1、探讨改良线栓对局灶脑缺血模型制备的影响    【摘要】  目的： 探讨改良线栓对局灶脑缺血模型制备的影响，评价该模型的稳定性和可靠性. 方法： 雄性Wistar大鼠40只随机分为常规线栓组和改良线栓组，每组20只. 线栓法制备右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)致局灶脑缺血模型. 观察改良线栓对总体手术时间、术中颈总动脉血流阻断时间、线栓误入翼腭动脉（PPA）几率（PPA误栓率）和模型成功率的影响，并通过神经行为学评分、红四氮唑(TTC)染色和磁共振检测等方法评价该模型的稳定性和可靠性. 结果： 改良线栓组比常规线栓组总体手术时间和术中颈总动脉血流阻

2、断时间明显缩短，线栓误入PPA的几率降低，模型成功率高，稳定可靠. 结论： 改良线栓可增加模型成功率，提高局灶脑缺血模型的稳定性和可靠性. 【关键词】  脑缺血；疾病模型，动物；缝合技术；大脑中动脉闭塞；大鼠【Abstract】 AIM: To investigate the application of modified suture in preparation of rat model of focal cerebral ischemia and to evaluate the stability and reliability of the model. METHODS: 4

3、0 Wistar male rats were randomized into the conventional suture group and the modified suture group, with 20 in each group. The focal cerebral ischemia by MCAO was induced according to Longas suture method. The effects of the application of modified suture on the total operation time, the common car

4、otid artery blood occlusion time during the course of operation, the probability that suture entered the pterygopalatine artery (PPA) and the success rate were observed. And the stability and the reliability of the model were evaluated by neurological deficit score, magnetic resonance image, triphen

5、yltetrazolium chloride (TTC) staining in all rats. RESULTS: The total operation time and the common carotid artery blood occlusion time in the modified suture group were obviously shorter than those in the conventional suture group. And the application of modified suture in the model cut down the pr

6、obability that the suture entered PPA, and increased the success rate, the stability and the reliability of the model. CONCLUSION： The application of modified suture could improve the success rate, the stability and the reliability of the rat focal cerebral ischemia induced by MCAO.【Keywords】 brain

7、ischemia; disease models, animal; suture techniques; middle cerebral artery occlusion; rats0  引言    大鼠的基因与人类的基因具有98%的同源性，其脑血管结构与人类非常相似，血管闭塞后缺血范围恒定、重复性好. 因此，众多有关脑缺血的研究均选用大鼠来制备模型1-2. 制备大鼠局灶脑缺血模型的方法较多，但以线拴法应用最广. 线栓法制备局灶脑缺血模型目前还存在某些不足，如线栓插入困难，栓塞成功率不高，梗塞体积不稳定等3.  这与线栓直径、弧度以及术中颈总动

8、脉血流阻断时间等因素密切相关.本研究重在对线栓弧度进行改良，观察改良线栓对局灶脑缺血模型的影响.1  材料和方法1.1  材料  健康雄性Wistar大鼠40只，体质量220250 g，810 wk龄，购自重庆医科大学实验动物中心，适应性喂养1 wk后，随机分为常规线栓组和改良线栓组，每组20只.    选用“贵花田”牌鱼线，直径0.230.26 mm，参照Ma等4的方法略加修改，制备改良线栓. 先将鱼线剪成3 cm长的小段，6070加热2 h将鱼线小段塑呈弧形，弧形外切角为30°时最佳，可确保线栓弧度与大鼠颈内动脉走行一致

9、. 自然冷却后，头端约5 mm涂上聚胺酯，用油性记号笔在线栓头端和距头端约2 cm处作上标记，以方便植入线栓时调整线栓方向，了解线栓进入血管的长度. 制备常规线栓时，除不进行加热塑型外，其余步骤相同.制备好的线栓头端向上，垂直插在海绵垫上，风干，紫外线消毒后备用. 使用前在生理盐水配制的肝素钠(6250 u/mL)溶液中浸渍可用.1.2  方法  参照Longa等5和罗勇等6报道的方法，采用经颈内动脉线栓法制备大鼠右侧MCAO致局灶性永久性脑缺血模型. 35 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，颈前区备皮、消毒. 取颈正中切口逐层切开皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，

10、切断二腹肌前腹，暴露右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)，颈内动脉(internal carotid artery，ICA)和颈外动脉(external carotid artery，ECA)，探查颈外动脉在颈部发出第一分支（甲状颈干）处，在其远心端（偏嘴侧）约0.2 cm处结扎并切断ECA，确保ECA残端长度不短于0.5 cm；游离、凝闭并切断ECA与ICA之间的交通支. 用蛙心夹暂时阻断CCA及ICA血流，用11号手术尖刀于ECA残端作一纵行小切口，将线栓从右侧ECA残端插入ICA；轻轻牵拉ECA残端，使其与ICA成一条直线，调整线栓角度，使改良线栓弧度水平向

11、外，与颈前正中线呈45°水平向外的夹角，移去夹闭ICA的蛙心夹，轻轻将线栓送入颅内. 从CCA分叉处送入ICA约1.92.1 cm时通常可遇阻力，且大鼠呼吸、心跳突然加快，部分大鼠尿失禁，借此可作为大脑中动脉起始处栓塞成功的标志. 若不能顺利将线栓送入颅内，可再度调整线栓与ICA的角度，或再夹闭ICA更换线栓；若线栓插入过程中，线栓进入血管内的长度小于1.5 cm即遇阻力（通常为 1 cm左右），同时大鼠出现轻微的右侧面肌抽动，提示线栓误入翼腭动脉（pterygopalatine artery，PPA），须拔线栓至ECA残端，再度调整线栓角度，重新插入. 栓塞成功后，用丝线结扎ECA

12、残端，移去夹闭CCA的蛙心夹，观察无活动性出血后关闭切口.1.2.1  神经行为学评分  造模后3 h，进行Longa法神经功能缺损评分5，评判模型成功与否. 评分为14分者为成功模型. 造模后12 h，再根据Longa评分综合评定各组大鼠损伤程度，并进行统计分析.1.2.2  磁共振（MRI）检查和红四氮唑(TTC)染色  采用TOSHIBA VISART 1.5T超导磁共振成像机，膝正交线圈(QD). 于MCAO后12 h（行神经行为学评分后）再次麻醉，仰卧位固定，行头颅T2WI检查.    各组大鼠在MCAO后12 h

13、行MRI检查后，深麻醉，断头取脑，将大脑整体标本置于20 g/L TTC溶液中37孵育30 min，可见边界清楚的脑梗死灶. 用数码相机拍照后，再将大脑置于-20冰箱中快速冷冻15 min，以视交叉平面为中心连续冠状切片5张，厚度5 mm，重复上述染色约30 min，可在冠状位见白色梗死灶. 将脑片置入40 g/L多聚甲醛溶液中固定过夜，用数码相机拍照. 经电脑图像分析量化脑梗死绝对体积占对侧大脑半球体积的百分比，即相对脑梗死体积.     统计学处理： Longa评分以等级资料表示，采用秩和检验；率的比较采用2检验；计量数据用x±s表示，行t检验. 采

14、用SPSS10.0统计软件包进行统计分析. 检验水准=0.05，以P<0.05为差异具有显著性意义.2  结果 2.1  手术评估  动物麻醉固定后，常规线栓组通常需要（28.6±10.1） min，而改良线栓组一般只需（16.3±3.8） min即可顺利完成手术. 两组总体手术时间差异显著（t=2.97，P<0.01）. 改良线栓组术中CCA血流阻断时间为（384.8±165.7） s，明显比常规线栓组（669.2±170.1） s缩短（t=4.31，P<0.01）；改良线栓组线栓PPA误入率（13.0%

15、）明显低于常规线栓组（30.6%），差异具有显著性（P<0.05）；模型成功率改良线栓组（95%）远高于常规线栓组（85%），差异具有显著性（P<0.05）. 提示改良线栓可明显缩短总体手术时间和术中CCA血流阻断时间，减少线栓误入PPA 的次数，明显提高模型成功率.2.2  神经行为学评分  造模后12 h，根据Longa评分综合评定各组大鼠损伤程度，改良线栓组模型大鼠Longa评分大多数为3分，而常规线栓组得分比较分散（表1）. 经秩和检验，两组差异具有显著性意义（P<0.05）. 提示改良线栓制备的局灶脑缺血模型损伤程度相近，稳定性较好.表1

16、0; 两组神经行为学评分（略）aP<0.05 vs常规线栓.2.2.1  脑梗死体积  造模后12 h，MRI成像及TTC染色所显示脑梗死病灶（呈白色）范围一致，主要累及右侧大脑中动脉供血区的皮质和皮质下白质和纹状体. 全脑TTC染色显示右侧大部分大脑皮质已梗死（呈白色），仅残存额极、颞极、部分枕叶和靠近中线的部分顶叶. 由T2WI测得的相对脑梗死体积改良线栓组（69.6±0.6）%比常规线栓组（68.6±0.6）%稍有增加，但差异无显著性（P>0.05）. TTC染色所计算的脑梗死相对体积与MRI所测结果相一致（图1）.（A： MRI T2

17、相冠状位最大梗死层面； B： TTC染色冠状位最大梗死层面； C： MRI T2相水平位最大梗死层面； D： 全脑TTC染色显示脑梗死范围）.图1  MRI扫描和TTC染色显示改良线栓组脑梗死病灶（略）3  讨论    1986年Koizumi等7首次采用线栓法成功制备大鼠大脑中动脉闭塞致局灶脑缺血模型. 此后Longa等对线栓法进行了适当改进，被广泛用于实验性局灶脑缺血,包括局灶脑缺血/再灌注损伤的研究7-8. 目前，Koizumi法和Longa法已成为线栓法制备局灶脑缺血模型的经典方法. 线栓法制作大鼠局灶脑缺血模型的机理是用线栓阻塞颈内动

18、脉和后交通动脉的血流，同时栓线的前端到达大脑前动脉的起始部，阻塞大脑前交通动脉的血流，使一侧大脑中动脉血流完全阻断8.     既往在制备此模型过程中需结扎颈内动脉分支PPA，阻断颅外来源的侧支循环，并防止栓线误入PPA5. 但实际操作中，颈内动脉PPA分支位置较深，分离结扎困难，操作过程中对血管刺激较大，易引起血管收缩痉挛，使得线栓与颈内动脉颅内段不能完全匹配，通常出现插入线栓的直径偏小，大脑中动脉起始部闭阻不全或根本没有闭阻，致使模型症状不典型或造模失败. 因此，有学者探索性研究了在不结扎PPA的情况采用线栓法制备大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤模型，结果非常成功，

19、脑梗死部位和病灶都很典型9. 本研究借鉴此研究成果，在预实验中详细研究了大鼠颈部血管的走行和分支，发现PPA自颈内动脉颅外段分出后走行变异不大，与颈内动脉颅内段大都呈30°左右的夹角. 因此，本研究重在对线栓进行改良，将线栓预先塑成弧型，使之与颈内动脉走行一致；术中不用暴露和分离PPA，而是在线栓植入颈外动脉残端后，推进线栓的过程中，用镊子调整好线栓的方向和角度，使线栓弧度水平向外，线栓与颈前正中线呈45°夹角，避免线栓头端进入PPA，有效降低了线栓插入PPA的几率，缩短了总体手术时间和颈总动脉夹闭缺血时间. 本研究结果显示，采用预先塑型的弧形线栓制备大鼠局灶脑缺血模型，能

20、在较短时间内顺利将栓子植入颈内动脉颅内段，减少术中反复插栓和调整栓子角度的机会，减轻栓子对颈内动脉的刺激，尽可能降低颈内动脉痉挛的发生. 这有利于将线栓前端送达大脑前动脉的起始部，造成大脑中动脉血流完全阻断，提高了模型的成功率.    本研究还发现，缩短术中颈总动脉缺血时间是提高模型稳定性的重要措施. 改良线栓组术中颈总动脉缺血时间比常规      线栓组明显缩短，其模型动物的脑缺血损伤程度非常接近，Longa评分多为3分，而常规线栓组颈总动脉缺血时间相对较长，模型动物Longa评分数据分散，脑缺血损伤程度轻重不一

21、. 这与颈动脉缺血时间短，血管痉挛较轻有关. 因此，为提高模型稳定性，术中应尽可能缩短颈总动脉缺血时间.【参考文献】  1 Ginsberg M, Busto R. Rodent models of cerebral ischemiaJ. Stroke,1989, 20（12）:1627-1642.2 陈 静, 李树清. 影响局灶性脑缺血实验的有关因素J. 微循环学杂志, 2006,16(2):56-57,61.3 胡 凌, 高培毅. 线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型影响因素的探讨J. 中国医学影像技术, 2004, 20(10):1624-1626.4 Ma J, Zhao L, Nowak TS Jr. Selective, reversible occlusion of the middle cerebral artery in rats by an intraluminal approach. Opt