基因组半定量PCR方法检测肿瘤组织的基因缺失

1、    基因组半定量PCR方法检测肿瘤组织的基因缺失        摘要：目的用PCR方法检测肿瘤组织中抑癌基因的缺失状况。方法PCR半定量技术。结果10对标本有5对发现缺失，80 %与Southern 杂交结果相符合。结论半定量PCR技术可以替代Southern杂交，成为检测基因缺失的一种便利手段。关键词：基因缺失；PCR中分类号：Q503文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)02-0135-03DETERMINATION OF GENE DELETION

2、IN TUMOR TISSUE BY SEMI-QUANTITATIVE POLYMERASE CHAIN REACTIONSUN Fen-yongWAN Da-fangQIN Wen-xin（National Laboratory for Oncogene and Related Genes,Shanghai Cancer Institute （Shanghai 200032,China）Abstract：ObjectiveTo determine the deletion of tumor suppressor gene in tumor tissue by PCR.MethodsSemi

3、-quantitative PCR assay.Results5/10 of the samples with partially loss of the SFY gene had been picked out by this method,and 80 % of them had been confirmed by Southern blot.ConclusionSemi-quantitative PCR technique can replace Southern blot to be a convenient way to investigate gene deletion in tu

4、mor tissue.Key words：Gene deletion；Semi-quantitative PCR随着分子生物学技术的发展，出现了多种不同的染色体缺失检测技术，应用最广的是染色体遗传位标多态性检测和Southern杂交技术，但前者依赖于待检区域内多态位标的存在，后者虽然无此要求，但仍有较多问题：1)模板用量大，2)步骤烦琐，同位素用量大，3)依赖于限制性酶切片段长度的多态性，若内切酶选择失当，很难正确反映缺失情况，4)对于纯合子的单等位基因缺失，杂交方法无法检测。最近，本实验室利用YAC和BAC为探针，筛选了正常人肝cDNA文库，得到一批肝癌相关抑癌基因候选阳性克隆，本研究尝试用

5、半定量PCR技术替代Southern杂交，对其中的阳性克隆SFY在肝癌组织中的缺失状况进行检测。材料与方法材料PCR扩增试剂盒(Promga)，PCR循环仪(Genius)，GelDoc1000(BioRad),Du7500紫外分光光度仪(Beckman)。方法10对肝癌和癌旁组织标本，酚/氯仿抽提DNA，紫外分光法定量。PCR反应体系为5l：10×buffer,15 mmol/L Mg2+，1 mmol/L dNTP各0.5 l，18.5KBq -32PdATP,模板20 ng,引物终浓度0.5 mol/L，0.2 U Taq酶，MinQ水补足体积。反应条件：94 4 min，94

6、、60、72各30s，25个循环，72 10 min。取产物2.5 l行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压150V，曝光8 h，用GelDoc1000测定感光强度，按下述公式测定R值：R=D待检-D背景/D内参-D背景其中R为待检基因参照于内参的相对量，D待检和D内参分别为待测产物及内参的感光强度，D背景为相同面积背景强度。Southern杂交按分子克隆介绍方法进行7，酶切使用MspI和EcoRI，探针为本实验室筛库所得的阳性噬菌体亚克隆产物。结果首先研究本系统条件下，PCR循环数与产物的关系，发现28个循环内，PCR扩增处于指数期(见1)，考虑到定量的准确性，同时又有足够的产量以便观察，本实验采用25

7、个循环。作者选用一个高度肝癌相关的侯选抑癌基因SFY作为对象，Southern杂交检测该基因在10对肝癌及癌旁标本中的状况，发现其中5只肿瘤标本有显著的LOH(Loss of heterozygosity)(见2)。应用PCR半定量方法检测SFY基因在上述10对标本中的缺失状况，PCR产物为该基因一个外显子，大小135bp，内参为-actin,产物大小350bp。作者设定：R癌/R癌旁2/31PCR循环数与产量关系当循环数小于28次时，产量呈线性增加为判断LOH的标准，结果显示共有5只肿瘤标本发生LOH，其中4只与Southern杂交结果相符，符合率为80 %，另有一对标本未被Southern

8、杂交检出(见表1和3)。2Southern杂交检测标本G5，Q9其中G5发生LOH L：癌旁组织，K：癌组织表1GelDoc1000测定发生LOH的感光强度G3G5G8Q6D12LKLKLKLKLKDSFY8012885135931347210664119D-actin131135140130157155167156136133D背景192192192192192192192206206206R1.841.122.060.922.831.573.622.002.031.19RK/RL0.610.450.550.550.59单位：PDU(pixel density unit);L:癌旁组织；K：

9、肝癌组织；R=RK/RL=DSFY-D背景/D-actin-D背景 3基因组半定量PCR检测标本G3，G5，G6，G8其中G3，G5，G8的癌组织中SFY基因PCR产量较癌旁明显减少，即发生部分缺失。L：癌旁组织K：癌组织讨论许多研究者一直致力于用PCR技术对基因组进行定量的工作。数年前，有人用该技术成功地筛选到Duchenne/Becker肌萎缩相关基因的几个高缺失区，并可诊断出缺失基因的携带者(一对等位基因中丢失一个基因)，使此方法成为该领域的热点13，6。Pastire报道，他们的系统可以检测出基因拷贝数1/3的差异4。一般认为PCR反应分两个阶段：指数期和平台期4，5。指数期内，产物扩

10、增倍数与扩增效率的对数呈线性关系，适合定量。但若将内参与靶基因分开扩增，不同反应的扩增效率不同，内参失去意义，许多报道中，采用这种方法缺乏根据。本研究对两者行双重PCR扩增，增加了定量的科学性。平台期内，由于产物增加缓慢，不适于定量。在我们的反应体系中，循环数小于28为指数期，因此本实验选择25个循环。此时产量较小，须用-32P dATP掺入法，而一些报道中使用EB染色进行定量，可信度令人怀疑。在确定LOH标准时，一般认为LOH是单个等位基因的缺失，因此，只有当R癌/R癌旁1/2时才有LOH的产生，结果5对LOH标本中只有1对符合这一标准，考虑到癌组织中存在少量正常组织，以及标本收集时癌和正常

11、组织的确定有一定的人为误差，最后将LOH的标准放宽到R癌/R癌旁2/34，使LOH检出符合率达到80%(相对于Southern杂交)，证明这一标准较为合理，其中有一对Southern杂交结果为阳性，而此方法为阴性，可能与肿瘤标本中污染有正常组织有关。另外，有一标本Southern杂交检测未发现缺失，而本方法发现有明显的LOH，经过重复，排除了偶然误差的影响后，仍然是相同的结果。作者认为，用杂交检测缺失依赖于限制性酶切片段长度的多态性，若内切酶选择不适当，很难正确反应基因缺失的实际情况，事实上对于每一个标本都找到最适当的酶是不可能的，此外，若待检基因为纯合子，杂交法也将无能为力。本方法则直接从基

12、因的拷贝数出发，检测待检基因的状态，增加了检测的敏感性。综上所述，由于本方法反应体系小，同位素有量少，操作简便，周期短，有较高的敏感性，而且可以弥补Southern杂交的不足，因此是一种检测染色体缺失的好方法，特别是对大量标本进行检测时，用作初步筛选，并以其它方法相配合，不失为一种较理想的方案。基金项目：国家重点基础研究发展规划资助项目(G1998051209)作者简介：孙奋勇，男，博士研究生作者单位：孙奋勇（上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实险室上海 200032）?万大方（现在江苏省中西医结合研究所分子生物学研究室南京210037）覃文新（现在江苏省中西医结合研究所分子生物学研究室

13、南京210037）顾健人（现在江苏省中西医结合研究所分子生物学研究室南京210037）参考文献1Abbs S,Bobrow M,Kleanthous K.Analysis of quantitative PCR for the diagnosis of deletion and duplication carriers in the dystrophy geneJ.J Med Genet,1992,29:1912Ioannou P,Christopoulous G,Panayides K,et al.Detection of Duchenne and Becker muscular dystr

14、ophy carriers by quantitative multiple polymerase chain reaction analysisJ.Neurology,1992,42:17833Mansfield ES,Robertson JM,Lebo RV,et al.Duchenne/Becker muscular dystrophy carrier detection using quantitative PCR and fluorescence-based strategiesJ.Am J Med Genet,1993,48:2004Lucio P,Maria GC,Giulia

15、F,et al.A quantitative polymerase chain reaction assay completely discriminates between Duchenc and Becker muscular dystrophy deletion carriers and normal femalesJ.Mol Cell Probes,1996,10:1295Lubin MB,Toyoda H,Middleton M,et al.Precise gene dosage determination by polymerase chain reaction:theory,methodology,and statistical approachJ.Mol Cell Probes,1991,5:3076Beggs AH,Koenig M,Tedeshi S,et al.D